第二章基因重组与基因工程.docVIP

中南大学生物科学与技术学院 分子生物学研究中心 教 案 授课科目: 授课内容:授课对象：授课时数：学时授课：授课地点：授课时间： Genetic Recombination and Genetic Engineering 一、目的要求： 掌握：限制性核酸内切酶的概念和特点； 常用克隆载体的结构特点； 目的基因的获取方法；克隆载体的选择；外源基因与载体的连接；重组DNA导入受体菌；重组体的筛选。 熟悉：DNA聚合酶I、Klenow片段、连接酶等常用的工具酶；克隆基因的表达。 了解：同源重组；重组DNA技术与医学的关系。 二、讲授重点： 重组DNA技术基本原理及操作步骤 三、讲授难点： α－互补筛选 四、教学方法：多媒体教学多媒体课件DNA Recombination 同源重组 发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。 第 二 节 重组DNA技术 一、重组DNA技术相关概念 （一） DNA克隆 1．克隆(clone) ：来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 2．获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。 3．DNA克隆：应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。 4．基因工程(genetic engineering) —— 实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。 （二）工具酶 1．限制性核酸内切酶（restriction enzyme） 限制性核酸内切酶是基因克隆中最重要的工具酶，主要从原核细胞中提取。它是一种核酸内切酶，能从双链DNA内部特异位点识别并且裂解磷酸二酯键。 2． DNA聚合酶Ⅰ 有聚合酶活性, 3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性, 5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性。 3．DNA聚合酶Ⅰ大片段 DNA聚合酶Ⅰ大片段(large fragment of DNA polymerase I)为DNA聚合酶I用枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)裂解后产生的大片段，这个片段也称为Klenow片段（Klenow fragment）。 有5ˊ→3ˊ聚合酶活性, 3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性, 无5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性 4． 逆转录酶 是一种RNA依赖的DNA聚合酶，即以RNA为模板合成DNA，合成时需要四种脱氧核苷酸及3ˊ-OH引物，合成方向为5ˊ→3ˊ延伸，无3ˊ→5ˊ外切酶活性。广泛用于以mRNA为模板合成cDNA，构建cDNA文库。 5． T4DNA连接酶 T4 DNA连接酶催化双链DNA一端3ˊ-OH与另一双链DNA的5ˊ端磷酸根形成3ˊ→5ˊ磷酸二酯键，使具有相同粘性末端或平端的DNA两端连接起来。 6. 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase） 能去除DNA或RNA 5ˊ端的磷酸根。制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身连接，提高重组效率。 7. 末端脱氧核苷酸转移酶 末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT），简称末端转移酶。它的作用是将脱氧核苷酸加到DNA的3ˊ-OH上，主要用于探针标记；或者在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接。 （三）目的基因 ? cDNA (complementary DNA) ? 基因组DNA (genomic DNA) （四）基因载体 载体的选择标准 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。 1. 质粒 (plasmid) 质粒是存在于多数细菌和某些真核生物染色体外的双链环状的DNA分子。 质粒含有复制起始点，此复制起始点与其他一些顺式调控因子构成复制子，能利用细菌染色体DNA复制和转录的同一套酶系统，在细菌体内独立地进行自我复制及转录。 作为克隆载体的质粒应具备下列特点： （1）分子量相对较小，能在细菌内稳定存在，有较高的拷贝数。 （2）具有一个以上的遗传标志，便于对宿主细胞进行选择，如抗生素的抗性基因，β-半乳糖苷酶基