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第四章 微生物细胞的破碎 知识点：细胞壁的组成和结构，微生物细胞的破碎技术，破碎率的测定。 重点：工业生产中常用的几种细胞破碎方法的原理，操作过程及常用设备，并能就实际生产情况予以合理的选择。 难点：常用破碎方法的合理选用。 破碎的动力学方程为：ln[1／（l－R）]＝KNPα 其中 R——破碎率； K——与温度有关的速度常数； P一操作压力； N一悬浮液通过匀浆器阀的次数。 α——与微生物种类有关的常数； 破碎酵母菌,α值可取2. 2。可见，影响破碎的主要因素是压力、温度和通过匀浆器阀的次数。 作业: 1. 常用细胞破碎方法(珠磨法、高压匀浆法、超声破碎法、酶溶法、化学渗透法)的原理、特点及适用性。 2. 举例说明采用多种破碎方法相结合提高破碎率的机理。 使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。 气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-30℃的气流中吹干； 真空干燥多用于细菌。 4.干燥法 气流干燥 真空干燥 喷雾干燥 冷冻干燥 三、破碎率的测定与破碎技术的研究方向 细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上升。导电率随着破碎率的增加而呈线性增加 。 1. 破碎率的测定 直接测定法 目的产物测定法 导电率测定法 采用染色的方法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。 如破碎的革兰氏阳性菌可染成革兰氏阴性菌的颜色； 采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，完整的细胞呈紫色，而受损害的细胞呈亮红色。 将破碎后的细胞悬浮液离心分离细胞碎片，测定上清液中目的产物（如蛋白质或酶）的含量或活性，并与100%破碎率所获得的标准数值比较，计算其破碎率。 细胞破碎与固液分离紧密相关。 2.破碎技术的研究方向 多种破碎方法相结合 与上游过程相结合 与下游工程相结合 化学法、酶法、机械法相结合。 如用溶解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆，95MPa压力下匀浆4次，总破碎率接近100%。而单独采用高压匀浆法，同样条件下破碎率只有32%。 在发酵培养过程中，培养基、生长期、操作参数（如pH、温度、通气量、搅拌转速、稀释率等）等因素都对细胞壁膜的结构与组成有一定的影响。细胞的破碎与上游培养过程有关。 用基因工程的方法对菌种进行改造，以提高胞内物质的提取率也是非常重要的。 在生长后期，加入某些能抑制或阻止细胞壁物质合成的抑制剂（如青霉素、环丝氨酸等），继续培养一段时间后，新分裂的细胞其细胞壁有缺陷，利于破碎； 选择较易破碎的菌种作为寄主细胞，如革兰氏阴性细菌； 在细胞内引进噬菌体基因，培养结束后，控制一定条件（如温度等），激活噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出内含物。 * * 为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微生物细胞壁的组成和结构（表1）： 多聚糖 （80-90%） 脂类 蛋白质 葡聚糖 （30-40%） 甘露聚糖 （30%） 蛋白质 （6-8%） 脂类 （8.5-13.5%） 肽聚糖 （5-10%） 脂蛋白 脂多糖 （11-22%） 磷脂 蛋白质 肽聚糖 （40-90%） 多糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖 （1-4%） 主要组成 多层 多层 多层 单层 层次 100-250 100-300 10-13 20-80 壁厚/nm 霉菌 酵母菌 革兰氏阴性细菌 革兰氏阳性细菌 微生物 一、细胞壁的组成和结构 细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结构越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳性细菌的坚固； 酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度； 由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。 不同种类的细胞结构差别很大，破碎的难易程度也不同，由难到易的大致排列顺序为：植物细胞＞真菌（如酵母菌）＞革兰氏阳性细菌＞革兰氏阴性细菌＞动物细胞。 二、常用破碎方法 条件变化剧烈，易引起大分子物质失活 改变细胞膜渗透性 干燥法 破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物 反复冻结-融化 冻结融化法 破碎率较低，常与其他方法结合使用 渗透压剧烈改变 渗透压法 具一定选择性，浆液易分离，但释放率较低，通用性差 改变细胞膜的渗透性 化学渗透法 具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，溶酶价格高，通用性差 酶分解作用 酶溶法 非 机 械 法 破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目的产物不适合 固体剪切作用 X-press法 对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作 液体剪切作用 超声破碎法 可达较高破碎率，可大规模操作，不适合丝状菌和含有包含体的基因工程菌 液体剪切作用 高压