原位杂交技术及其在水产养殖动物病毒性疾病诊断中的应用.pdfVIP

一 7l一 中国动物检疫 2010年第 27卷第 3期 lIl 持人：袁丽萍yp652@h。mi．。。m 原位杂交技术及其在水产 养殖动物病毒性疾病诊断中的应用 蔡玉勇 ’，任伟成 ，王崇明29于佐安 。，李 贺 (1．中国海洋大学，山东青岛 266003； 2．中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东青岛 266071；3．辽宁省海洋水产研究所，辽宁大连 116023) 摘 要：本文介绍了原位杂交技术的发展概况、基本原理和应用价值，并概述 了原位杂交技术在水产养殖动物 (包括鱼、虾、贝类)病毒性疾病的检测、定位和体内表达模式等方面的应用。此外，还对该技术的应用前景进行了展 望。 关键词：原位杂交；地高辛标记；水产养殖；检测 中图分类号：S94；0527 文献标识码：A 文章编号：1005—944X(2010)O3一OO71—03 原位杂交技术 (insituhy— 定位 。1987年 BoeringerMannhem Biering等0利用原位杂交检测 bridization ISH)作为一种有效的 Biochemisca将地高辛标记的有关试 人工感染传染性胰脏坏死症病毒 核酸杂交技术，使组织病理学的研究 剂及药盒投放市场，相 比放射性标记 (IPNv)大西洋比目鱼卵黄囊幼虫，结 从器官、组织和细胞水平走 向分子水 物，地高辛较放射性标记系统安全， 果表明在幼虫肠、肝脏和肾脏均有病 平。原位杂交技术灵敏度高、特异性 方便、省时间。同时在敏感性和质量 毒存在，靶位点在感染细胞的细胞质 强、检测快速 ，不但可以对检测样品 控制方面比生物素标记技术要优越， 内。Comps等 利用标记狼鲈神经坏 进行病毒或细菌的定性检测又可进 同时有较好的反差背景，更有利于与 死病毒 (DIEV)片段的放射性探针和 行定位检测 ，还可进一步检测病毒或 免疫组织化学相结合，而且可以检测 地高辛探针分别检测三种不同的鱼， 细菌在寄主体内的表达模式。现 已广 基因表达。Haase等 首先采用PCR 两种探针均可以与 DIEV和尖吻鲈脑 泛应用于细胞或组织的基因表达、染 和原位杂交相结合 的方法检测 了羊 炎病毒 (LcEV)核酸杂交，但不能与双 色体分析、病毒诊断和发育生物学等 绒毛膜络丛细胞中的绵羊脱髓鞘性 RNA病毒科 (Birnaviridae)和小核糖 方面。 脑炎病毒，建立了原位 PCR(InSitu 核酸病毒科 (Picornaviridae)病毒 1 原位杂交技术的发展 PCR，ISPCR)技术，能在组织细胞原位 核酸杂交。陈晓艳等[5]通过注射神经 Gal1和 Pardue[1利用同位素标 检出低拷贝的特异性基因序列，甚至 坏死病毒(0GNNv)提取液人工感染斜 记的爪蟾核糖体基 因探针与其卵母 能检出仅有 1个拷贝的基因序列。 带石斑鱼，解剖感染病毒的斜带石斑 细胞杂交，确定该基因定位于卵母细 2 原位杂交技术原理 鱼，从中分离出脑和眼睛，利用原位 胞的核仁中，创立了原位杂交技术 。 原位杂交主要是利用碱基互补 杂交技术检测组织中的斜带石斑鱼 Orth应用H。标记的兔乳头状瘤病毒 原理，将体外合成并 已标记的核酸探 0GNNV。Huang等嘲应用原位杂交技术 cRNA探针与兔乳头状瘤组织 的冰冻 针与组织活细胞中的特定核酸发生 检测 自然感染新加坡石斑鱼虹彩病 切片进行杂交，首次用原位杂交技术 杂交，从而将探针定位在特定核酸的 毒 (SGIV)的点带石斑鱼 的靶位点及 定位病毒DNA在细胞中的靶位点。但 表达区域内。原位杂交所用的探针有 其敏感性，其中肾脏和脾脏组织的信 由于 同位素标记的探针使用时间受 RNA探针 、eDNA探针和DNA探针 ，可 号最强，肠和肝脏组织的信号相对较 半衰期的限制，而且其放射性对人体 以是双链 DNA探针也可 以是单链 cR— 强，胃和腮组织的信号最弱。在所有 有害并污染环境 ，限制 了其发展 。 NA探针；核酸探针根据标记物的不 检测组织中，阳性信号均特异性的定 Bauman等首先应用荧光素标记 cRNA 同，又可分为放射性探针和非放射性 位在