硫酸盐还原菌氢化酶的分离纯化及酶学性质研究.pdfVIP

维普资讯 第 37卷 第 3期 内蒙古师范大学学报 (自然科学汉文版) VoI．37No．3 2008年 5月 JournalofInnerMongoliaNormalUniversity(NaturalScienceEdition) May2008 硫酸盐还原茵氢化酶的分离纯化及酶学性质研究 常磊峰，邱广亮 ，陈香君 (内蒙古师范大学 生命科学与技术学院，内蒙古 呼和浩特 010022) 摘 要 ：硫酸盐还原菌氢化酶上清液经硫酸铵沉淀、透析、DEAE-52阴离子交换层析和 SephadexG一150凝 胶过滤层析纯化出氢化酶，纯化倍数为 34．7，酶回收率为 34．1％．对纯化酶性质进行研究 ，结果表明：该酶是 由分 子量为46KD和34KD的两个亚基构成的总分子量为 80KD的aB异二聚体 ；酶催化最适温度和 pH值范围分别 为 45℃和6．5～8．5，在 34~55℃和 pH=6～9．2范围内具有较稳定的催化放氢活力；光谱扫描分析和激活剂及 抑制剂测定表明该酶属含铁硫 中心的唯铁氢化酶． 关键词 ：硫酸盐还原菌；唯铁氢化酶 ；分离纯化 ；酶学性质 中图分类号 ：O629．8 文献标识码 ：A 文章编号 ：1001-8735(2OO8)O3一O412-05 氢化酶 (hydrogenase，简称 H：ase)是一类存在于微生物体内的重要生物酶，是催化伴有氢分子吸收与 释放的氧化还原反应酶，它通过控制微生物体内氢气的代谢来调节细菌的其他生理活动． 在微生物脱硫过程中，氧化态的污染物 ，如SO：、硫酸盐 、亚硫酸盐及硫代硫酸盐，必须先经生物还原作 用生成硫化物或 H。S，再经生物氧化过程生成单质硫而除去．硫酸盐还原菌 (SulfateReducingBacteria，简 称 SRB)是参与这类硫污染物还原的主要微生物 ，在 SRB氢化酶的催化下，氢气可特异性地将硫酸盐还原成 H。S，再通过硫氧化细菌将硫化氢氧化为单质硫而除去．目前对 SRB介导 的微生物脱硫研究多集 中在煤炭 脱硫研究上nl ，而对于 SRB介导的微生物脱除烟气 SO：的研究报道很少 ，对氢化酶的纯化也多来源于野 生型 SRB菌种．本研究所用高效硫酸盐还原菌菌种纯化 自内蒙古师范大学生命科学与技术学院实验室稳定 运行的烟气 SO。微生物脱硫系统厌氧磁性稳态流化床反应器(anMSFB)，并经脱硫系统长期驯化 ，从该菌 中 纯化出氢化酶 ，并对其酶学性质进行 了初步研究． 1 材料与方法 1．1 菌种、试剂和仪器 待烟气 SO：微生物脱硫系统 的厌氧磁性稳态流化床反应器稳定运行 100d后 ，取菌液 100mL，应用 Hungate的厌氧操作技术 引、绝迹稀释法以及滚管培养纯化出 1株硫酸盐还原菌，在含 2L硫酸盐还原菌培 养基的培养瓶中接种 ，充人氮气 ，置于 32℃富集培养 5Oh后 ，取菌液 以石蜡油封 Ill，在 13000×g下离心 40min，收集菌体湿细胞 3Og，--20℃保存备用． 阴离子树脂 DEAE-52，凝胶 SuphadexG-150、低分子量标准蛋 白(TaKaRa)、聚乙二醇 (PEG，2O000)、 ATP、GTP、AMP、EDTA等均为 Sigma进E1分装，培养基及其他化学试剂均购于上海华美生物工程公司． CO,夹层培养箱：美 国NUAIR公司．超声波碎仪：SONICS，100W ／20kHz，美 国产．冷冻真空干燥仪： FTS，美 国NUAIR公司．凝胶成像系统 ：DIGIDOC，美 国产．超速离心机 (6M)：Beckman公司，美国产．柱层 析系统：BioRad公司．垂直板电泳仪 ：BioRad公司．紫外／可见分光光度计 (UV--2000)：莱伯泰科(北京)有 限公司． 收稿 日期；2007—11一o3 基金项 目：国家 自然科学基金资助项 目 作者简介，常磊晦 (1981一)，男，内蒙古集宁人，内蒙古师范大学硕士研究生，通讯作者，邱广亮 (1964一)，男，山东高密人，内蒙古师范大 学教授 ，主要从事生物化学与分子生物学研究．