PCR重测序常见问题解答-Sanger测序及Oligo合成.pdfVIP

PCR重测序常见问题解答-Sanger测序及Oligo合成.pdf

  1. 1、本文档共5页,可阅读全部内容。
  2. 2、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
  3. 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载
  4. 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
  5. 5、该文档为VIP文档,如果想要下载,成为VIP会员后,下载免费。
  6. 6、成为VIP后,下载本文档将扣除1次下载权益。下载后,不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们
  7. 7、成为VIP后,您将拥有八大权益,权益包括:VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
  8. 8、VIP文档为合作方或网友上传,每下载1次, 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等,对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
查看更多
PCR重测序常见问题解答-Sanger测序及Oligo合成.pdf

Sanger 测序及Oligo 合成 Fosmid 文库构建 为什么Fosmid 文库菌液存放一段时间后,再次鉴定时无法达到原有库容量? 答:Fosmid 文库构建完成后请尽量及时进行单克隆保菌,包装产物和侵染后的菌液不 宜放置时间过长,否则会有严重的插入片段丢失现象。 cDNA 文库构建及EST 测序 1. 如何提高cDNA 文库的测序效率,减少反复测到同一个基因,从而获得更多的Unigene? 答:为了得到更多的Unigene,需要构建全长均一化cDNA 文库,均一化文库可以降低 高表达基因的丰度,同样测序量可大大增加发现低丰度基因的频率,从而得到更有价值的 稀有基因。 2. EST 测序结果为什么仅为5’端测序? 答:由于mRNA 的3 ’端有PloyA 结构,容易引起测序酶滑动,因此,EST 测序一般是 从5 ’端测序。3 ’端测序成功率较低,不建议进行3 ’端测序。 酵母双杂交文库构建 构建酵母双杂交文库时,转化大肠杆菌和转化酵母菌有什么区别? 答:转大肠杆菌可以加入均一化步骤,提高后期文库筛选效率,并可以对文库进行提 取质粒,测序检测。后期提取质粒方便,并且文库可以加甘油-80 ℃长期保存,不一定需 要扩增。但其缺点是无法直接用于后期酵母双杂交筛选,需要提取质粒后重新转入酵母菌, 才能用于后续筛选,操作相对繁琐。 转化酵母细胞Y187 可以直接用于后续酵母双杂交筛选试验,经过百万克隆扩增,文 库可以多次使用,保存期长。但技术繁琐,成功率低,成本高,且酵母质粒提取困难,无 法通过测序鉴定文库质量。 PCR 重测序 如果有一个已知的10k 左右的大片段,可以进行PCR 重测序吗?如果不可以,有无其他方 案可以解决? 答:如果有参考序列,同源性至少要在98% 以上才可进行重测序,并且如果序列中有特 殊结构,可能会无法测通,如果同源性较低或重测序遇到困难,可以采用建Shotgun 库测序 的方法,通过多重覆盖得到全长序列。 TA 克隆 TA 克隆送样时应注意什么? 答:由于在PCR 过程中,使用的DNA 聚合酶不同,往往分为2 种情况: 1)使用不同的Taq 酶,在PCR 扩增循环结束后,在72℃继续反应10 分钟,Taq 酶可以 在扩增产物的3 ′末端加上A ,因此PCR 产物回收纯化后可以和T 载体直接连接; 2 )使用高保真的DNA 聚合酶,如pfu 酶,由于其不能在扩增产物的3 ′末端加上A , 得到的DNA 序列为钝端,因此,需要在回收纯化后进行加A 的过程,然后将加A 产物直接 用于TA 连接。所以,送样时,一定注明样品是否已经加A 。 BAC/Fosmid 末端测序 BAC 或Fosmid 末端测序成功率为什么那么低? 答:BAC 和Fosmid 克隆插入片段较大,质粒较难提取,很难达到上机测序的样本量要 求,另外,如果在不可诱导的情况下,提取的难度也会大大增加,因此测序的成功率较低。 单个样品测序 1. DNA 测序的原理是什么?ABI3730xl 型测序仪测序的准确度如何? 答:DNA 测序的原理是双脱氧核糖核酸末端终止法,具体可以参见《分子克隆》;ABI3730 测序仪采用AB 公司最新配套的测序试剂,该测序对碱基的判读有一个自身的评判值(Quality Value ),根据QV 值的大小,可以帮助我们来判读每一个碱基的准确度。ABI 公司目前承诺 标准品测序结果达到929bp,达到Q20 标准的数据在80% 以上。 2. 菌液在客户那里能培养出来,为什么到华大科技培养不出来? 答:可能存在以下几种情况: 1)您送的是新鲜菌液,可能样品在送到我们公司的途中耽搁时间较长,菌已失活,如 果需要长途寄送,建议您送穿刺菌。 2 )该菌株比较特殊,需要特殊培养基以及特殊环境培养,如果是这种情况,我们建议 您送2ml 以上培养好的新鲜菌液或质粒。 对于宿主菌,我们建议使用DH5α、DH1 和C600E.coli 菌株,XL1-Blue E.coli 菌株也可以, 但其生长过慢。JM 系列、TG1 系列和HB101 系列E.coli 菌株会产生大量的碳水化合物,应 尽量避免使用。 3. 我的样品送测序前已经鉴定过,存在插入片段,为什么测序结果是一个空的质粒?这样 的结果收费吗? 答:可能是以下两种原因: 1)鉴定过程呈现假阳性。鉴定插入片段主要是通过PCR 和酶切两种方式鉴定。由于PCR 反应受多种因

您可能关注的文档

文档评论(0)

aiwendang + 关注
实名认证
文档贡献者

该用户很懒,什么也没介绍

1亿VIP精品文档

相关文档