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PCR重测序常见问题解答-Sanger测序及Oligo合成.pdf
Sanger 测序及Oligo 合成
Fosmid 文库构建
为什么Fosmid 文库菌液存放一段时间后,再次鉴定时无法达到原有库容量?
答:Fosmid 文库构建完成后请尽量及时进行单克隆保菌,包装产物和侵染后的菌液不
宜放置时间过长,否则会有严重的插入片段丢失现象。
cDNA 文库构建及EST 测序
1. 如何提高cDNA 文库的测序效率,减少反复测到同一个基因,从而获得更多的Unigene?
答:为了得到更多的Unigene,需要构建全长均一化cDNA 文库,均一化文库可以降低
高表达基因的丰度,同样测序量可大大增加发现低丰度基因的频率,从而得到更有价值的
稀有基因。
2. EST 测序结果为什么仅为5’端测序?
答:由于mRNA 的3 ’端有PloyA 结构,容易引起测序酶滑动,因此,EST 测序一般是
从5 ’端测序。3 ’端测序成功率较低,不建议进行3 ’端测序。
酵母双杂交文库构建
构建酵母双杂交文库时,转化大肠杆菌和转化酵母菌有什么区别?
答:转大肠杆菌可以加入均一化步骤,提高后期文库筛选效率,并可以对文库进行提
取质粒,测序检测。后期提取质粒方便,并且文库可以加甘油-80 ℃长期保存,不一定需
要扩增。但其缺点是无法直接用于后期酵母双杂交筛选,需要提取质粒后重新转入酵母菌,
才能用于后续筛选,操作相对繁琐。
转化酵母细胞Y187 可以直接用于后续酵母双杂交筛选试验,经过百万克隆扩增,文
库可以多次使用,保存期长。但技术繁琐,成功率低,成本高,且酵母质粒提取困难,无
法通过测序鉴定文库质量。
PCR 重测序
如果有一个已知的10k 左右的大片段,可以进行PCR 重测序吗?如果不可以,有无其他方
案可以解决?
答:如果有参考序列,同源性至少要在98% 以上才可进行重测序,并且如果序列中有特
殊结构,可能会无法测通,如果同源性较低或重测序遇到困难,可以采用建Shotgun 库测序
的方法,通过多重覆盖得到全长序列。
TA 克隆
TA 克隆送样时应注意什么?
答:由于在PCR 过程中,使用的DNA 聚合酶不同,往往分为2 种情况:
1)使用不同的Taq 酶,在PCR 扩增循环结束后,在72℃继续反应10 分钟,Taq 酶可以
在扩增产物的3 ′末端加上A ,因此PCR 产物回收纯化后可以和T 载体直接连接;
2 )使用高保真的DNA 聚合酶,如pfu 酶,由于其不能在扩增产物的3 ′末端加上A ,
得到的DNA 序列为钝端,因此,需要在回收纯化后进行加A 的过程,然后将加A 产物直接
用于TA 连接。所以,送样时,一定注明样品是否已经加A 。
BAC/Fosmid 末端测序
BAC 或Fosmid 末端测序成功率为什么那么低?
答:BAC 和Fosmid 克隆插入片段较大,质粒较难提取,很难达到上机测序的样本量要
求,另外,如果在不可诱导的情况下,提取的难度也会大大增加,因此测序的成功率较低。
单个样品测序
1. DNA 测序的原理是什么?ABI3730xl 型测序仪测序的准确度如何?
答:DNA 测序的原理是双脱氧核糖核酸末端终止法,具体可以参见《分子克隆》;ABI3730
测序仪采用AB 公司最新配套的测序试剂,该测序对碱基的判读有一个自身的评判值(Quality
Value ),根据QV 值的大小,可以帮助我们来判读每一个碱基的准确度。ABI 公司目前承诺
标准品测序结果达到929bp,达到Q20 标准的数据在80% 以上。
2. 菌液在客户那里能培养出来,为什么到华大科技培养不出来?
答:可能存在以下几种情况:
1)您送的是新鲜菌液,可能样品在送到我们公司的途中耽搁时间较长,菌已失活,如
果需要长途寄送,建议您送穿刺菌。
2 )该菌株比较特殊,需要特殊培养基以及特殊环境培养,如果是这种情况,我们建议
您送2ml 以上培养好的新鲜菌液或质粒。
对于宿主菌,我们建议使用DH5α、DH1 和C600E.coli 菌株,XL1-Blue E.coli 菌株也可以,
但其生长过慢。JM 系列、TG1 系列和HB101 系列E.coli 菌株会产生大量的碳水化合物,应
尽量避免使用。
3. 我的样品送测序前已经鉴定过,存在插入片段,为什么测序结果是一个空的质粒?这样
的结果收费吗?
答:可能是以下两种原因:
1)鉴定过程呈现假阳性。鉴定插入片段主要是通过PCR 和酶切两种方式鉴定。由于PCR
反应受多种因
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