DNA重组酶FLP原核表达与多步法纯化及活性检测.pdfVIP

卷 期 生 物 工 程 学 报 ! # ’( )! *’ )# 年 月 !$$% % !#$%% ’()*$+, (- .#(/%0$(,(12 +,(- !$$% !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! !# 重组酶$% 原核表达与多步法纯化及其活性检测 ’()*’+(,-. /01’233-(4 (5 !# 62.(78-4*32 $% *49 :,3 ;’-5-.*,-(4 -,= /4+7*,-. #.,-?-,+ 盖 颖，王文棋，陆 海，蒋湘宁 ， ， U9V W1=E X9*U X/=QY1 ZN [1 =3 +V9*U \1=EQ*1=E 北京林业大学生物科学与技术学院，国家林业局树木花卉育种与生物工程重点开放实验室，北京 K$$$P !(,,%1% (- 3#- % 40#%$0% +$5 .#(/%0$(,(12 ，.%#6 #$1 7(*%/*2 8$#9%*#/2 ，:% :*%% +$5 ;*$+%$/+, =,+$/ .*%%5#$1 +$5 .#(/%0$(,(12 3+(*+/(*2 (- 4/+/% 7(*%/*2 ， ， ?5#$#/*+/#($ .%#6 #$1 K$$$P !#$+ 摘 要 重组酶 存在于酵母 质粒上，能识别 的 位点，并根据 个 位点的相对方向完成位点间 4*9 HZL !! #6: H.? ! H.? 4*9 序列的交换、重组、删除与逆转，在现代分子生物学理论研究与基因工程技术开发中具有广泛应用。构建了在原核大肠杆菌 中高效表达HZL 重组酶的表达载体:YS!QF(:/ 并建立起相应的原核高效表达体系，在原核细菌大肠杆菌]KJ 菌株中实现HZL 酶蛋白的高效表达，同时建立了相应的纯化方法。纯化时先用硫酸铵沉淀法富集HZL 酶蛋白，经透析脱盐后再用镍离子鳌合 微柱（ ）亲合层析梯度洗脱的方法获得纯化的 酶蛋白。通过构建含有 个方向相同的 序列位点的质粒 $ ^J _ K^$5Z HZL ! H.? 和含有 个 位点的表达载体 ，并分别以其为底物来检测 重组酶的删除、交换与重组功 :NIKPQH.?QEF:QH.? K H.? :S?$QH.? HZL 能的活性。结果表明，该方法不仅能有效表达HZL 酶蛋白，并能行之有效地纯化 HZL 酶蛋白，以及检测纯化的HZL 酶蛋白对 4*9 序列的删除、重组与交换功能。该方法简单易行并能获得有活性的HZL 酶蛋白，为深入研究其机理以及研发相应的4*9 重组技术提供重要参考。 关键词 重组酶 ，高效表达，硫酸铵沉淀，亲合层析，交换活性 HZL 中图分类号 文献标识码 文章编号 （ ） YPK# ^ K 9