快速分选高纯度细胞(流式细胞术).pdfVIP

快速分选高纯度细胞 郑 义 流式细胞分选技术能帮助我们做什么？ 分选原理： 分选时，符合分选条件的颗 粒一旦被检测到，包含该颗 粒的液滴被充电。带电的液 滴通过被充电的偏转板，受 静电力作用，带电液滴将偏 转到收集管中，未带电的液 滴不偏转而流入废液槽。 CD4，CD8细胞分选 DC细胞分选 中性粒细胞分选 巨噬细胞分选 B细胞分选 探讨几个问题 ： 一、怎样做到高速分选 二、对于分群不明显的样品，如何提高分选纯 度 三、对于含量低且分群不明显的样品，如何提 高分选纯度 一、高速分选：淋巴细胞分选 提高分选速度的措施： 提高样品浓度 降低样品粘度，去除粘连细胞 1.加入抗凝剂（EDTA盐溶液） 2.上机前过滤 样品处理要求：单细胞，死细胞少 分选组织来源的细胞，常需要用机械或酶 的方法来分散细胞。将组织剪成小块后，处理 要尽可能快，以减少细胞死亡。 细胞成团时，靶细胞可能与非靶细胞粘在 一起，会严重影响分选纯度；如果因为分选冲 突舍弃这一团细胞，会导致回收率下降。培养 液中来自溶解细胞的DNA可引起细胞成团。含 酶 的氯化镁溶液有助于减少细胞成团。 DNA I 二、对于分群不明显的样品，如何提高分 选纯度 参考等高图设门 分选 双阳性细胞 目的细胞个体较大 选取较大的一群细胞 重新设定分选门 分选门不宜过大 直接圈门分选的结果 参考等高图圈门分选 参考等高线图圈门分选的结果 三、对于含量低且分群不明显的样品， 如何提高分选纯度 根据收集细胞的图上位置设门 先试分选，再修改门的位置和大小 分选小鼠精细胞，染PI，从活细胞中 分选GFP+细胞，试分选 根据试分选结果，重新确定分选门的位置 和形状 设好门后开始正式分选 设门准确才能保证分选细胞的纯度 四、除分选时门的设定外，样品制备的因素 也会影响分选结果，主要有以下几方面： 1.样本识别和分辨率 2.细胞活性 1.蛋白浓度影响样本识别和分辨率 如果样本缓冲液与周边鞘液折射系数不一样会影 响散射光的检测。 培养液中细胞的活性需要一定浓度的蛋白维持， 脆弱的细胞需要的蛋白浓度更高。为提高分辩率，被 样本缓冲液包裹的颗粒要求光干扰程度最低。样本缓 冲液中如果蛋白浓度太高，可产生纹影效果，在鞘液 和样本的边界处形成动态的液体透镜。 由于提高了光密度和含蛋白缓冲液的折射系 数，盐溶液中的蛋白与不含蛋白的鞘液间形成折射 偏差。当光透过折射系数不一样的介质时，光会弯 曲，最后导致散射光信号的失真。用最低的可保持 细胞活性的蛋白浓度，尽量降低FSC和SSC的信号变 化。 如果实验对分辨率要求极高，鞘液和样本缓冲 液一致可提高分辨率。如染色体分析分选时，对仪 器CV值要求很高。因此染色体分选时，需要用对染 色体有稳定作用的多胺缓冲液作为鞘液。如果需要 用含蛋白的鞘液，为减少产生泡沫，蛋白的浓度也 要尽量低。 2.保持细胞的活性 脆弱的细胞和衰老的细胞对鞘液压力比较敏感， 分选的细胞要落入含蛋白的培养液中，如果落在收集 管的管壁上，管壁上如果没有培养液覆盖，细胞就容 易死亡。 温度影响细胞活性 分选后纯度不高 阴性细胞个体小，疑似死细胞 对分选后的细胞染PI，检测活性 控制分选温度，细胞死亡率降低 分选时的温度也会影响细胞活性。目 前Aria 对于分选前及分选后的控温做的都 比较好，我院正研发鞘液控温技术以实现 分选全程控温，已获中科院立项资助。 谢 谢 ！