人教版教学教案多聚酶链式反应扩增DNA片段 课件 2.pptVIP

多聚酶链式反应扩增DNA片段 多聚酶链式反应（PCR） 1、概念： 又称为基因的体外扩增法，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA片段的技术，它能以极少少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝，能有效地解决因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。 2、PCR原理 （1）DNA复制的条件： 模板——亲代链 原料——核苷酸 能量——ATP 酶——解旋酶等 适宜的温度：PCR仪自动调控 适宜的PH：用一定的缓冲溶液调节 （2）参与的组分： （3）DNA复制方向：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3`端延伸DNA链，故DNA复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3`端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5`端向3`端延伸。 （4）DNA的热变性原理：在80~100℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性；当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链，这个过程称为复性。 （5）PCR反应的条件： 一定的缓冲溶液； DNA模板； 分别与两条模板链相结合的两种引物； 四种脱氧核苷酸； 耐热的DNA聚合酶； 控制温度； 3、PCR过程 3、PCR过程 DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。 配方及微量移液器 实验步骤 实验操作循环程序 DNA含量的测定 练习巩固 * * 使DNA聚合酶能够从引物的3`端开始连接脱氧核苷酸 引物 催化合成DNA子链 DNA聚合酶 合成子链的原料 4种脱氧核苷酸 提供DNA复制的模板 DNA母链 打开DNA双链 解旋酶 在DNA复制中的作用 参与的组分 5’ 3’ a 第一轮 引物2 5’ 3’ 引物1 3’ 5’ 3’ 5’ 引物2互补链 5’ 3’ 引物1互补链 b 第二轮 变性 新引物 新延伸 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ c 第三轮 以第二轮产物为模板，重复第二轮过程。 5’ 3’ 引物1 引物2互补链 引物2 引物1互补链 引物1 引物2 第一次 第二次 第三次 第四次 引物2互补链 目的片段 （不同长度的链未示出） PCR反应的温度循环周期 PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性1min， 60 ℃退火1min， 72 ℃延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。 温度（℃） 时间（min） 94 72 60 94℃变性（1min） 60 ℃退火（1min） 72 ℃延伸（1.5min） 循环1 循环2 循环3 准备好PCR反应体系的配方 用微量移液器按配方在往微量离心管中加入各组分 盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁混合反应液 离心10分钟 将离心管放入PCR仪上，设置好循环程序进行反应 稀释→对照调零→测定→计算 DNA含量（ug） 50×（260nm的读数） ×稀释倍数 1、关于PCR技术的应用，错误的一项是 A 古生物学、刑侦破案、DNA序列测定 B 诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学 C DNA序列测定、基因克隆、刑侦破案 D 诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNA序列测定 *