无选择标记的植物表达载体的构建.pdfVIP

维普资讯 园 艺 学 报 2008，35 (5)：701—706 AetaHorticuhuraeSinica 无选择标记的植物表达载体 的构建 辛翠花 ，刘庆昌 ，屈冬玉 ，黄三文 (中国农业大学农学与生物技术学院，北京 100094； 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081) 摘 要：以双元载体 pBINPLUS为基础 ，在 T—DNA侧翼区通过2次特异PCR、酶切和连接相结合的方 法 ，构建了1个无标记载体 pBINMF(marker—freevector)。通过酶切后测序分析，这个无标记载体在T—DNA 左 、右边界之间只有 1个多克隆位点 (multipleclonedsites，MCS)。为了验证该载体的遗传稳定性 ，将 gus 基因克隆到该载体上并通过农杆菌介导的方法转化番茄栽培品种 M‘oneymaker’，特异 PCR扩增 目的基因 和GUS组织染色结果表明，gus基因已经整合进入番茄基因组并得 以表达。该载体为今后直接获得无标记 基因、生物安全的转化体，尤其可为马铃薯、木薯等无性繁殖材料的无标记基因转化提供可靠、有效的工 具 。 关键词：无标记转化；载体构建；转基因；番茄 中图分类号：S641．1 文献标识码：A 文章编号：0513—353X (2008)05-0701-06 The Construction ofa Binary Vector for M arker-free Transformation in Plants XIN Cui—hua’ LIUQing．chang’，QUDong．yu’ ，andHUANGSan．wen ， (C‘ollegeofAgronomyandBiotechnology，ChinaAgriculturalUniversity，Bering100094，China；lr~stituteofVegetablesand Flowers，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100081，China) Abstract：Amarker-freevector(pBINMF)derivedfrom thebinaryvectorpBINPLUSwasgenerated， whichonlycontainedamultipleclonedsitebetweenleftandrightbordersasvalidated byrestrictionanalysis andsequencing．InordertoidentifytheefficiencyofpBINMFfortransformation，thegusgenewasclonedinto thevectorandwasintroducedintothetomatocuhivarMoneymakerviaAgrobacterium tumefaciens-mediated transfomr ation．Gene-specificPCR andGUS stainassayshowed thatgusgenewasintegratedintothetomato genomeandWasexpressed．Thisvectorcouldbecomeareliableandefficiefittoolfordire~tgeneratni‘gmarker- freetransfomr antsinplants，particularlyusefulforvegetativelypropagatedcropslikepotatoandcassava． Keywords：marker-freetransformation；vectorconstruction；transgene；tomato 众所周知，利用农杆菌介导的转基因频率很低，因此在转化过程中往往利用标记基因辅助选择来 筛选为数很少的阳性转化体。但是由于这些筛选标记基因多数为一些编码抗生素抗性 (Bevaneta1．， 1983)和除草剂抗性 (Shaheta1．，1986)的基因，它们对生态环境和食物安全性的影响引起了消费 者和环境学家的普遍关注和担忧。因此有研究者在转化时使用标记基因，而在得到阳性转化体后通过 各种手段将筛选标记基因去除 (Komarieta1．，l996；Gleaveeta1．，1999；Zubkoeta1．，2000；O