03哺乳动物组织基因组DNA提取.pptVIP

2005-3-22 2005-3-21 2002级生物技术专业 2004-2005（下）分子生物学实验 Genomic DNA Extraction from Mammal Tissue 哺乳动物组织基因组DNA提取 一、实验目的(Experimental Purpose) After the experiment is finished, students should be able to extract genomic DNA from mammal tissue, and to run an agarose gel. 真核生物染色体DNA组装不同层次的结构 We can add the eathylene diamine tetraacetic acid (EDTA) to keep the integrity of DNA. EDTA can chelate Mg2+ and reduce deoxyribonuclease (DNase) activity, because these enzymes require Mg2+ to work. 为了进一步保护DNA样品的完整性，通常需要在缓冲液中添加乙二胺四乙酸(EDTA)以整合Mg2+，这样将会减少脱氧核糖核酸酶(DNase)的活性，因为该酶必须在有Mg2+存在时才会起作用。 本实验方法分离得到的染色体DNA长度为100-150kb，适用于构建基因组文库和Southern杂交分析。如果要求得到较大分子量的DNA，则必须省略其中的振荡步骤。 核酸的分离纯化、测定及研究方法 一、 分离核酸的一般原则 因为遗传信息全部贮存在核酸的一级结构中，故完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的基础。 （一）核酸的分离和纯化时应遵循两个原则① 保证核酸一级结构的完整性；② 排除其它分子的污染。 （二）核酸的纯度要求 ① 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； ② 其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度； ③ 排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然。 （三）核酸分离纯化的注意事项 为保证分离核酸的完整性和纯度，在实验中应注意： ① 尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏； ② 减少化学物质对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH4～10条件下进行； ③ 防止核酸的生物降解。细胞内或外来的各种核酸酶水解核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。其中DNA酶需要金属二价阳离子Mg2+，Ca2+的激活，因此使用金属离子螯合剂，如EDTA或柠檬酸盐等基本上可以抑制DNA酶的活性。而RNA酶不但分布广泛、极易污染样品，而且耐高温、耐酸碱、不易失活，所以生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素； ④ 减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高温。 高温：如长时间煮沸，除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的某些化合键也有破坏作用。核酸提取过程中常规操作温度为0～4℃以降低核酸酶的活性从而减少对核酸的生物降解。 机械剪切力：包括强力高速的溶液振荡、搅拌，细胞突然置于低渗液中；细胞爆炸式地破裂及DNA样品的反复冻融等。这些操作细节在实验操作中应加倍注意。机械剪切作用的主要危害对象是大分子量的线性DNA分子，如真核细胞的染色体DNA等。 二、核酸分离纯化的一般步骤 破碎细胞→去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子→沉淀核酸→去除盐类、有机溶剂等杂质→纯化干燥→溶解。 核酸提取方案，应根据具体生物材料和待提取核酸分子的特点而定。对于某特定细胞器中富集的核酸分子，采用先提取细胞器后再提取目的核酸分子的方案，可获得完整性和纯度两方面质量均高的核酸分子。 三、试剂与器材(Reagents and apparatus) Ⅱ. Material Liver of rabbite Ⅲ. Reagents Tris、SDS、EDTA、 HCl、 NaOH 、 Sodium acetate (NaAc)、 Acetic acid (HAc)、 Phenol、Chloroform、Ethanol、Isoamylol、 TE buffer 、Protease K、RNase A、Agarose、DNA molecular weight markers 、Boric acid、Sugar、Bromophenol blue、 Fluorescent dye (Gelview) （一）储备液的制备 四、实验步骤(Experime