猪CDKN1C和NAP1L4基因印迹分析.docVIP

猪的CDKN1C和NAP1L4基因的描述、组织表达和印迹分析 人类CDKN1C/KCNQ1OT1印记域中的CDKN1C和NAP1L4基因是与贝-韦综合征和癌症有关的两个关键的候补基因。为了增进对猪中的这两种基因的了解，本文将对它的cDNAs进行分析。通过IMpRH模板，猪的CDKN1C 和NAP1L4基因被分配给猪的2号染色体，分别与IMpRH06175在 15.78 和17.94的检测限下有紧密联系。采用荣昌猪和长白猪相互杂交的F1代，通过实时定量rt - pcr和polymorphism-based方法对两个基因的组织和等位基因表达进行测定。尽管猪的CDKN1C和NAP1L4基因在1月龄猪的肺和肾脏中显示出最高的表达水平(P0.01)，但是两者在胎盘组织中的转录水平显著高于其他新生组织。印迹分析表明，CDKN1C在新生仔猪的心脏、舌、膀胱、卵巢、脾脏、肝脏、骨骼肌、胃、小肠和胎盘等组织中呈母系表达，在新生仔猪的肺和肾脏中呈双等位基因表达，而NAP1L4被验证在上述12种新生组织中呈双等位基因表达。总的说来，CDKN1C印迹在哺乳动物中保守存在但在新生猪组织中具有组织特异性，而NAP1L4印迹在哺乳动物中存在争议。 1.前言 基因印迹，由于体细胞的表观遗传调控，其中某些基因的单等位基因表达取决于亲本的源性，它对哺乳动物新生胎儿的生长发育，胎盘的功能以及产后的行为至关重要。很多研究已经表明，基因组印迹的中断与先天性疾病、癌症以及其他种类的疾病例如贝-维综合征和普拉德-威利综合征等有关[1-4]。目前，在小鼠的基因组中估计有大约2114种转录印迹和600种潜在的印迹基因[5,6]，其中有大约116种印迹基因已经被发现，但是只有几种印迹基因在猪中被发现。因此，有必要在猪中找寻出更多的印迹基因，从而提供新的数据和观点给猪的功能基因组学和比较基因组学研究。 很多印迹基因在基因组的集合和基因顺序以及在每个印迹域中的印迹显示出老鼠和人类之间的相当大的相似性[7,8]。据报道，CDKN1C和 KCNQ1OT1存在于人类11p15.5和老鼠7号染色体末端的一个印迹集群中。在这个区域的基因包括OSBPL5,CARS,NAP1L4,PHLDA2,SLC22A18,SLC22A18AS,CDKN1C,KCNQ1DN,KCNQ1OT1,KCNQ1,TSSC4, CD81和 ASCL2 [8]。CDKN1C/KCNQ1OT1域的印迹中断与贝-维综合征和癌症的发生有关[8]。 CDKN1C(细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂)和NAP1L4（核小体组装蛋白1 ，4）是2个在人和老鼠印迹集群中特别有意义的基因。CDKN1C，也被称作 p57Kip2，编码一个属于CIP / KIP家族的编码细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（CDKI），是一个假定的肿瘤抑制基因[9,10]。CDKN1C基因突变已经在大约5–20%的贝-维综合征患者中得到确认[11,12]，小鼠母体CDKN1C继承的缺失表现出一定的BWS的特点[13]，而在散发性肿瘤、胚胎性肿瘤患病个体中CDKN1C的基因突变非常罕见[14-18]。NAP1L4，也称为NAP-2,编码一个和 NAPs具有同源性的蛋白质，通过从细胞质运送组蛋白到染色质装配机构参与基因表达的调控[19]。NAP1L4与抑制胎儿的生长发育，造成胎儿死亡的过程有关[20]。这些结果表明，CDKN1C和NAP1L4是两个重要的与BWS和癌症发生有关的基因[8]。 目前，有很多关于CDKN1C和NAP1L4在人和老鼠中的印迹状态的报道。CDKN1C是从母体等位基因表达，而NAP1L4除了在老鼠的胎盘母系表达外，在其他所有组织中均为双等位基因表达[21]。在猪中，CDKN1C是母系表达预期[22]。尽管取得了一些进展，但猪CDKN1C、NAP1L4的相关数据仍然有限。因此，将在这篇文章中对猪CDKN1C、NAP1L4在组织中的表达模式和印迹状态进行研究。这项研究将有助于提高对猪CDKN1C、NAP1L4功能重要性的认识。 材料和方法 2.1 组织样品和cDNA的准备 用8头长白猪和8头中国本土品种的荣昌猪进行正反杂交（每个品种各4头公猪和4头母猪）。这些公猪和母猪，必须没有共同的祖父母。从23头上述杂交后的F1代猪中提取组织，组织包括心脏，胃，骨骼肌，肾脏，肺，肝，小肠，膀胱，舌，脾脏，脂肪，卵巢和胎盘。23头F1代猪包括10头出生24小时的新生崽猪（5头来自 3对不同父母的LD × RC，另5头来自3对不同父母的RC × LD）以及7头来自4对不同父母的LD ×RC的F1代1月龄仔猪和6头来自4对不同父母的RC ×LD的F1代1月龄仔猪。亲本猪的耳组织中提取基因组DNA，基因分型的CDKN1C