重组半胱氨酸脱巯基酶AtLCD的表达、纯化及酶学性质.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３３（１１）：８１３ 重组半胱氨酸脱巯基酶ＡｔＬＣＤ的表达、 纯化及酶学性质 １ １，２ １ １ １ １ 袁慧虹 　梁雅丽 　沈洁洁 　张丽萍 　刘志强 　裴雁曦 （１山西大学生命科学学院　太原　０３０００６　２山西省生物研究所　太原　０３０００６） 摘要　目的：在重组大肠杆菌中表达重组拟南芥Ｌ半胱氨酸脱巯基酶ＡｔＬＣＤ（ＨＳ内源产生关键 ２ 酶），确定最佳诱导表达和纯化条件，并研究重组酶的酶学性质。方法：对大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ ｐＥＴ２８ａＬＣＤ进行异丙基Ｄ硫代半乳糖苷 （ＩＰＴＧ）诱导培养，将纯化的目的蛋白ＡｔＬＣＤ进行酶 β 学性质的研究。结果：重组蛋白的最佳诱导表达条件为０．１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ，３０℃诱导３ｈ。５００ ｍｍｏｌ／Ｌ的咪唑洗脱Ｎｉ柱可得较纯的目的蛋白。重组酶性质研究结果表明，酶的最适ｐＨ为９．５， 最适作用温度为３７℃，最适条件下的以ＬＣｙｓ为底物的米氏常数 （Ｋｍ）为１．５７２ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｖｍａｘ ２＋ ３＋ 为１．５２ｎｍｏｌ／ｍｇ·ｍｉｎ。金属离子 Ｍｇ ，Ｆｅ 和 ＥＤＴＡ对重组酶的活性有一定的抑制作用， ２＋ ２＋ ２＋ ２＋ Ｂａ 、Ｃａ 和Ｃｏ 在一定程度上提高了酶的活性，其中Ｃｏ 效果更强。蛋白变性剂 ＳＤＳ和酶抑 制剂羟胺也不同程度地抑制了酶的活性。结论：明确了重组ＡｔＬＣＤ的酶学性质和最佳诱导表达 及纯化条件，为该ＬＣＤ的深入研究和气体信号分子ＨＳ在植物应答逆境胁迫机制的研究奠定了 ２ 基础。 关键词　硫化氢　ＡｔＬＣＤ　酶学性质 中图分类号　Ｑ３４２ 　　继ＮＯ和ＣＯ后的第三气体信号分子ＨＳ，近年来 达量随着苗龄逐渐增加，在茎和茎生叶中的表达量明 ２ ［１２］ 已经成为生物学研究的新热点之一。哺乳动物中ＨＳ 显高于根、莲座叶和花器官。Ｓｈｅｎ等 发现原核表达 ２ ２＋ 已经被证实是一个分布广泛功能多样的信号分子，在 拟南芥ＡｔＬＣＤ的大肠杆菌可以增强细菌对镉 （Ｃｄ ） 保护心脏、舒张血管过程，诱导血管平滑肌细胞凋亡、 ２＋ 毒性的抵抗。相关文献表明在干旱及重金属Ｃｄ 胁迫 抑制血管平滑肌细胞增殖等多种调节过程中都有 ＨＳ 下植物体内的ＨＳ内源产生关键酶基因ｌｃｄ的表达量 ２ ２ ［１４］ ［１１，１３］ 的参与 。植物中ＨＳ生理作用的研究表明，ＨＳ作 会上调以应对逆境胁迫 。近年来植物体内ＨＳ的 ２ ２