Percoll不连续密度梯度沉淀法分离纯化淋巴细胞和淋巴母细胞.docVIP

Percoll不连续密度梯度沉淀法分离纯化淋巴细胞和淋巴母细胞 percoll连续梯度怎么配制？比如15%---75%的percoll连续梯度?答：根据你需要的具体密度梯度决定的，根据要分离的不同细胞种类，数量等等，也有用原液配的。也有用80％配的，不一定的。另外，percoll本身是低渗透压的，要用高渗透压溶液配成生理等渗透压溶液，然后使用，不然，细胞容易破裂。一般是先用9份Percoll与1份8.5％ NaCl或1.5MPBS混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液(0.85％ NaCl或0.15M PBS)稀释到所需浓度。即取Percoll原液与10倍浓缩的PBS以9：1的比例混合，此时溶液 为100％ Percoll，比重是1.127，毫克分子渗透压浓度为290mOsmol/kg Percoll浓度(％) ?70??? ?60 ?????50 ?????40 ?????30 ??????20 比重g／ml ?????1.090? 1.077 ???1.067? ?1.056 ??1.043 ???1.031 Percoll是经过聚乙烯吡咯烷酮 (polyvinyl pyrolidone, PVP) 处理的硅胶颗粒混悬液，对细胞无毒性和刺激性。Percoll混悬液的硅胶颗粒大小不一，经过高速离心后，可形成一个连续密度梯度，将比重不同的细胞分离纯化。 　　将1份10XPBS与9份Percoll贮存液混合，制成等渗Percoll悬液，此悬液被认为是100％Percoll悬液，其密度为1.1294g/ml。用PBS或细胞培养液稀释100％Percoll而获得所需密度的Percoll分离液用于相应细胞的分离。若分离淋巴细胞应使用1.0777g/ml，配制时用稀释液稀释60％即可。 　　取比重1.077的Percoll分离液X ml与离心管中，将等倍稀释的抗凝血1/2 X ml 小心叠加在分离液上，经水平离心（1500rpm）后，便得四个细胞层，从而分离出淋巴细胞。表层为死细胞残片和血小板，底层为粒细胞和红细胞，中间有两层，上层富含单核细胞，下层富含淋巴细胞。 该法是纯化淋巴细胞和单核细胞的一种较好的方法，淋巴细胞纯度高达98%，单核细胞纯度可达78%。基本原理：本文分离单核细胞所用方法是Percoll非连续性密度梯度离心法，主要是根据不同细胞间密度的差别进行细胞分离。此法易操作，且使用通常的实验设备即可完成。 试剂与器材 ·外周血单个核细胞 ·PBS 1×和PBS 10×（无Ca2+、Mg2+），含0.5mM EDTA ·胎牛血清（56，30分钟加热灭活） ·HCl 1mol/l ·Percoll分层液（密度=1.130g/ml,商品） ·4g/L台盼蓝染液（溶解在PBS液中） ·50ml聚丙烯圆锥管 ·毛细吸管 ·移液管（1、2、10ml） ·CO2孵箱 ·超净台 ·有旋转桶转子装置的离心机 ·PH计易生物仪器库：/yp/product-list-42.html易生物试剂库：/yp/product-list-43.html 操作步骤：所有的操作应该在无菌条件下进行 （一）不同密度Percoll分层液的配制 1.Percoll分层液储备液的制备：取未稀释的Percoll原液（从瓶中取）9ml+1ml PBS 10×（无Ca2+、Mg2+），用HCl 1PH至7.4 2. Percoll分层液（）（密度=1.080g/ml）的配制：取Percoll储备液3.12 ml（前一步配制）+1.88 ml PBS1×（无Ca2+ Mg2+） 3. Percoll分层液 （）（密度=1.069g/ml）的配制：取Percoll分层液（）2.68 ml+2.32ml PBS 1×（无Ca2+、Mg2+） 4. Percoll分层液（）（密度=1.060g/ml）的配制：取Percoll分层液（）2.32 ml +2.68 ml PBS 1×（无Ca2+、Mg2+） （二）不连续密度梯度制备 1. 将洗涤过的8×107外周血单个核细胞重新悬浮在2ml的Percoll分层液（）（密度=1.080g/ml）在这层液体的表面上轻轻铺上2ml Percoll分层液（）（密=1.069g/ml），后再于第二层液面上轻轻铺上2ml的Percoll分层液（）（密度=1.060g/ml） 2. 20，在旋转转子中1000×g离心上步所形成的密度梯度90分钟（慢慢增加速度，无制动停转）。 （三）单核细胞的分离 1. 离心后单核细胞存在于Percoll分层液（）和（）（密度较小的部分）之间的界面中。 2. 用毛细吸管仔细收集单核细胞。 3. 用含1-5%胎牛血清的PBS 1×液洗涤细胞3次，4，400×g离心5分钟，弃上清液。 4. 若需要进一步实验