猪源益生乳杆菌的分离、鉴定和筛选.docVIP

猪源益生乳杆菌的分离、鉴定和筛选 及ERIC-PCR分型研究 预防兽医学：林朝洪 指导教师：倪学勤 副教授 从33日龄约×太二元健康断奶仔猪消化道不同部位分离到231株疑似乳杆菌。通过耐酸性试验从其中75株菌中快速筛选出26株耐酸性好的菌株：ZN8、、、、、、、、、、、、、、、、(Lactobacillus amylovorus)7株、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)3株、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)6株、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)9株、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)1株。而根据16S rRNA基因测序结果鉴定为3种乳杆菌，即罗伊氏乳杆菌(L. reuteri)10株、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)15株、类肠膜魏斯氏菌(Weissella paremesenteroides)1株。 采用牛津杯法进行抑菌试验，从26株菌中筛选出对大肠杆菌O8(Escherichia coli O8)和沙门氏菌339(Salmonella 339)均有较强抑制作用的6株乳杆菌：ZB3、WN8、WN1、SNQ5、SBZ5、JJB3。对这6株乳杆菌进一步做耐胆盐试验、耐热性试验、生长试验，最终筛选出各种性能都很优良的2株乳杆菌：SBZ5和JJB3。用利福平MRS平板（利福平含量：10ug/mL）将这2株乳杆菌驯化成耐利福平的菌株，用于28日龄断奶仔猪的饲喂试验。 “肠道细菌基因间重复序列”(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus, ERIC)，也称为“基因间重复单位”(Intergenic Repetitive Unit, IRU)，是一类广泛存在于肠杆菌科细菌的重复序列。由于其在不同细菌种属甚至同一种内不同菌株之间的拷贝数和定位都不同，所以可结合PCR技术用于细菌的分类、鉴定与分型。 本实验用于乳杆菌的ERIC-PCR反应体系：总体积20uL，各成分工作浓度如下：Tris-HCl 10mmol/L，KCl 50mmol/L，MgCl2 3mmol/L，dNTP 250umol/L，ERIC1R(5-ATGT AAGCTCCTGGGGATTCAC-3)和ERIC2(5-AAGTAAGTGACT GGGGTGAGCG- 3)均为1umol/L，Long Taq DNA聚合酶0.05U，模板DNA 1uL。反应程序：预变性：94℃，5min；循环反应分为前后两个部分：前5个循环：变性：94℃，1min；退火：32℃，1min；延伸：72℃，2min；后40个循环：变性：94℃，0.5min；退火：48℃，0.5min；延伸：72℃，1min；最后延伸：72℃，10min。 从本试验基于ERIC-PCR构建的菌株的聚类图来看，ERIC-PCR用于乳杆菌分型的分辨力可达到菌株水平。前述的26株菌的ERIC-PCR条带大小在200bp-2000bp之间，聚类分析可把26株菌分为明确的三个类群：即26-A：7株罗伊氏乳杆菌(L. reuteri)(ZN8、、、、、、、、、、、、、、、、(L. reuteri)(ZB3、MBH5、KNZ4)。26-A的各菌株图谱相似率范围为52%-76%，26-B的各菌株图谱相似率范围为40%-92%，26-C的各菌株图谱相似率范围为37%-73%。如果2株乳杆菌的图谱相似率达到75%就可判定为同一菌株，则26-A的ZN8和SJBZ4为同一菌株，SJNH7和SJBH4为同一菌株；26-B的WN8、、、断奶仔猪 乳杆菌 分离 鉴定 筛选 ERIC-PCR分型