SOD测定方法.docVIP

酶液提取:称取鲜叶样品。0.5g于预冷的研钵中，加lml0.05mol/1 pH7.0磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。将提取液于10000转/分冷冻离心20分钟，上清液用于测定SOD, POD, CAT活力测定及丙二醛含量测定。 SOD： 测定SOD活性的试剂配制及用量: ①磷酸缓冲液(PH7.8) 0.05moI/L 3.1m1，空白为3.2m1; ②EDTA-Na2 1mg/m1 0.2mL; ③L一甲硫氨酸20mg/mL 0.2m1; ④核黄素0.1 mg/ml，吸取上清液0.2m1; ⑤NBT lmg/ml 0.2m1; ⑥提取酶液0.1ml，空白不加酶液。 反应总体积为4m1, 第1组、4000Lx光照30min，遮黑布终止反应(用光照培养箱，灯管全部打开即可)。 第2组、黑暗处理30 min。 置560nm处测定光密度。SOD活性单位以抑制NBT光化还原50%作为一个酶活性单位(u)，按以下公式计算SOD活性: 式中，Ack为照光管的吸光度值;AE为遮光管的吸光度值:V为样品液总体积((ml);Vt为测定时样品用量(ml); W为样品鲜重。 POD： 在试管中依次加入 4m1 0.3%愈创木酚(0.02mo1/1 pH6磷酸缓冲液配置)、 50ul酶液、 50 ul0.3%H202， 摇匀，立即计时，1分钟后在470nm波长下比色，每1分钟记录一次吸光度值，连续记录5分钟。以每分钟内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位(U)，按下式计算过氧化物酶活性: 式中:d A470为反应时间内吸光度的变化:Vt为提取液总体积(ml); W为样品鲜重(g); Vs为测定时取用酶液体积(ml); t为反应时间(min) 。 CAT 取酶提取液50 u 1， 加入3m1 0.05 mol/1 pH7.0磷酸缓冲液， 再加入0.3%H2O2 200 u1， 迅速摇匀，立即计时，1分钟后在UV-754分光光度计的240nm波长下比色，每1分钟记录一次吸光度值，连续记录5分钟。以每分钟内A240下降0.01为1个酶活性单位(U)，按下式计算过氧化氢酶活性: 式中: △A240为反应时间内吸光度的变化;Vt为提取液总体积(ml):w为样品鲜重(g); Vs为测定时取用酶液体积(ml); t为反应时间(min) MDA 取上清液1.5m1， 加入2.5m10.5%的硫代巴比妥酸(TBA)(用10%三氯乙酸配制)。 混合物于100℃沸水浴中加热20min，迅速冷却，于10000转/分离心20分钟，分别测定上清液在450, 532nm及600nm处的吸光度值。按以下公式计MDA浓度C( u mol/1)和含量(nmollgFW): C(u mol/1)=6.45 X (A532-A600)-0.56 X A450