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SSR法鉴定水稻两系杂交种纯度的运用与探讨Ⅲ。两个形态学差异较大的品种间掺杂回收试验 摘要：在两系杂交稻两优培九的大群体田间纯度鉴定中，定向掺入形态学差异较大的两系杂交稻新两优６３８０，逐株抽取田间植株叶片样品，运用ｓｓｒ法进行鉴定。结果表明，运用ｓｓｒ法能够准确地检测出掺入的新两优６３８０。在室内检测的谱带中发现，新两优６３８０的带型与两优培九不育系带型的位置相同。 关键词：两系杂交稻；大群体；掺杂回收；带型比对 ａｂｓｔｒａｃｔ： ｔｈｅ ｇｒｏｕｐｓ ｓｅｅｄｓ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ｔｗｏ－ｌｉｎｅ ｈｙｂｒｉｄ ｒｉｃｅ ｖａｒｉｅｔｙ ｌｉａｎｇｙｏｕｐｅｉ ９ ａｄｕｌｔｅｒａｔｅｄ ａｎｏｔｈｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｖａｒｉｅｔｙ ｘｉｎｌｉａｎｇｙｏｕ ６３８０ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｅｘｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ ｌｅａｖｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｓｓｒ． ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｘｉｎｌｉａｎｇｙｏｕ ６３８０ ａｄｕｌｔｅｒａｔｅｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘａｃｔｌｙ． ｔｈｅ ｓａｍｅ ｌａｎｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｘｉｎｌｉａｎｇｙｏｕ ６３８０ ａｎｄ ｌｉａｎｇｙｏｕｐｅｉ ９ ｓｔｅｒｉｌｅ ｌｉｎｅ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ． ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｔｗｏ－ｌｉｎｅ ｈｙｂｒｉｄ ｒｉｃｅ； ａ ｌａｒｇｅ ｇｒｏｕｐ； ａｄｕｌｔｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｃｏｖｅｒｙ； ｌａｎｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ 由于ｄｎａ提取方法的简化、琼脂糖凝胶电泳技术的运用，以及ｓｓｒ分子标记鉴定两系杂交水稻种子纯度具有快速、重复性好、多态性高等优点，使得ｓｓｒ法成为目前室内鉴定两系杂交水稻种子纯度时应用最为广泛的分子标记方法［１－６］。但是琼脂糖凝胶电泳成像的谱带分辨率低，信息量不充分，谱带的主带一般表现为不育系、恢复系和杂交种３种类型，不能区分不同的杂株类型。 为验证该方法的可靠性和准确性，前人的研究一般是在鉴定时，采取人为在鉴定样品中掺入该组合的恢复系、保持系、不育系的方法来检验［７－９］。但在田间正季种植鉴定条件下，用两系杂交水稻种子大群体定位掺杂回收，且对掺入的杂交种子杂株谱带特征的研究目前鲜有报道［１０－１３］。 此次研究的目的在于了解单对引物对亲缘关系较远的品种的识别率，验证单对引物ｓｓｒ法测定亲缘较远的两系杂交水稻种子纯度的准确性和可靠性，同时探讨样品中混入其他杂交种的谱带特征。 １ 材料与方法 １．１ 材料 试验材料是在通过系谱比较后，选用遗传背景不同、亲缘关系较远的两优培九（培矮６４ｓ×９３１１）和新两优６３８０（０３ｓ×ｄ２０８）两个品种。这两个品种由荆州市种子管理局从市场上抽取商品种子，并经生产企业确认。所用引物及试剂均由北京鼎国生物有限公司提供。 １．２ ｐｃｒ反应体系 ｐｃｒ扩增反应总体积１０　μｌ：１０×ｂｕｆｆｅｒ １　μｌ，１０　ｍｍｏｌ／ｌ ｄｎｔｐ ０．２　μｌ，５０　ｎｇ／μｌ ｐｒｉｍｅｒ ０．２　μｌ ＋０．２　μｌ，２　ｕ／μｌ ｔａｑ酶０．６　μｌ，２５　ｎｇ／μｌ ｄｎａ １　μｌ，ｄｄｈ２ｏ ６．８　μｌ。ｐｃｒ反应条件为：９４℃预变性４　ｍｉｎ；然后进行３５个循环的扩增，循环参数为９４　℃、１５　ｓ，５５　℃、１５　ｓ，７２　℃、３０　ｓ；最后在７２　℃下延伸７　ｍｉｎ。扩增产物在含ｅｂ的３％琼脂糖凝胶中进行电泳后，应用凝胶成像系统观察记录。 １．３ 掺杂和抽样方法 试验于２０１１年４月１５日播种，５月１５日移栽。小区单本栽植５００株苗，５０行，每行１０株，行距２６．７　ｃｍ，株距１６．７　ｃｍ。每个植株用４位数编号，前两位数表示所在的行数，后两位数表示所在行的位置，例如０５０８表示第５行的第８株。在两优培九田间鉴定移栽时，每隔9株混栽１株新两优６３８０。两个品种之间的植株特征特性差别较大，易于田间识别（表１）；同时两个品种之间的遗传背景差异较大，易于室内检出。 返青后按对应编号采取田间各植株的倒二叶叶片，用ｒｍ１１对两优培九进行室内分子检测，为了防止人为因素干扰，试验过程中将掺杂、田间鉴定和室内ｓｓｒ检测的操作分别由３批不同的专业人员独立完成。 １．４ 结果比对 在抽穗前及齐穗后分两次按ｇｂ／ｔ ３５４３．５－１９９５进行田间纯度鉴定，并将田间结果与室内ｓｓｒ法的纯度检出结果进行比对，验证室内与田间结果的一致性。 ２ 结果与分析 ２．１ 混入的杂株田间和室内鉴定结果 室内ｓｓｒ法将小区的所有植株都抽样检测，共检出杂株６８株，其中掺入的新两优６３８０共５０株，样品自有杂株１８株，掺入株的检出率为１００％