人肺腺癌细胞A的耐药性与放射敏感性的相关性研究.docVIP

摘要】 　　目的 研究肺腺癌细胞株A549及耐药株A549/DDP放射敏感性差异，探讨肺腺癌的耐药性与放射敏感性的关系。方法 对指数生长期的A549、A549/DDP细胞用6 mV直线加速器分成0、1、2、4、6、8、10、12 Gy 8个剂量点进行放射。倒置显微镜观察细胞的形态变化，并根据细胞克隆计数，计算SF2，绘制细胞存活曲线。结果 放疗后两种细胞株的细胞形态发生改变,部分细胞死亡、破碎。A549和A549/DDP细胞株的SF2分别为0.417和0.685。结论 肺腺癌肿瘤细胞产生耐药性后可以使其放射敏感性降低。 【关键词】 A549细胞；耐药性；放射敏感性 　　化疗和放疗结合的综合治疗是中晚期肺癌最常见的治疗模式，并多采用有铂类药物的诱导化疗方式，但是文献报道证明多次化疗后可以产生耐药性〔1，2〕。因此，放化疗如何结合，化疗后的耐药性对放射敏感性有何影响，成为人们关注的问题。本文对人肺腺癌细胞株A549与耐顺铂细胞株（A549/DDP）放射敏感性的变化进行研究，探讨耐药性对放射敏感性的影响。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 细胞株 　　人肺腺癌细胞株A549由黑龙江省肿瘤研究所提供，A549/DDP自湖南省万佰生物有限公司购买。 　　1.1.2 试剂及药品 　　优级胎牛血清购自中国医学科学院生物工程研究所；DMEM培养液购自(北京索莱宝公司)；胰酶由黑龙江省肿瘤研究所自行配制；二甲基四氮唑蓝（MTT）和二甲基甲砜（DMSO）为Sigma产品； 顺铂为科鼎医疗有限公司产品。 　　1.1.3 仪器 　　倒置显微镜为Olympus（日本产）；苏州市金燕净化设备厂生产的YJ1450B型医用净化工作台；北京医用离心机厂的低速离心机；电热手提式压力蒸汽消毒器为哈尔滨市松花江医疗器械厂生产；血球计数板为丹阳光学仪器厂生产；CO2恒温培养箱为美国REVCO RCO3000T，数码照像机为日本SONY T10。 　　1.2 方法 　　1.2.1 细胞培养 　　将A549细胞、A549/DDP细胞用高糖DMEM培养液培养（含10%的优级胎牛血清、青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml），放置37℃、5%CO2孵箱中培养。每日观察细胞生长情况,待细胞铺满整个培养瓶底面80%后，进行细胞传代。 　　1.2.2 观察细胞形态 　　分别取对数生长期的A549及A549/DDP细胞，生理盐水清洗换液后，在倒置显微镜下观察活细胞的形态结构，并拍照。放疗后细胞培养15 d，在倒置显微镜下观察活细胞的形态结构，并拍照。比较放疗前后的细胞形态变化。 　　1.2.3 细胞存活曲线 　　取指数生长期的A549及A549/DDP细胞接种于25 ml培养瓶中（两组细胞的具体细胞接种数见表1)，每种细胞分0、1、2、4、6、8、10、12 Gy共8个剂量点照射，照射源为VIRIAN 2300C/D型双光子直线加速器，能量6 mV，剂量率4 Gy/min，源皮距100 cm，细胞表面加1 cm厚的组织补偿物，每个剂量照射3瓶，常规照射后培养15 d后计数克隆形成。用1%结晶紫染色1 min,生理盐水冲洗完全后晾干，计数50个细胞以上的克隆数，计算每个剂量点克隆数的平均值，从而计算两组细胞每个剂量点的存活分数（SF），根椐单击多靶模型，绘制细胞存活曲线，求出各组的D0(指在存活曲线直线部分把SF从0.1降至0.037或从0.01降至0.003 7所需的剂量，是在每个细胞引起一次致死事件所需的平均剂量)、Dq(即准域剂量，是指将存活曲线的直线部分反向延长，通过SF 1.0与剂量轴相交处的剂量，用来代表存活曲线的肩宽)、SF2(指肿瘤细胞在2 Gy电离射线照射后的SF)，比较各组的放射敏感性。表1 A549、A549/DDP细胞株的接种细胞数（略） 细胞存活分数（SF）=受照射细胞的贴瓶率（PE）/对照细胞的贴瓶率(PE)×100%。 细胞贴瓶率（PE）=克隆数/细胞接种数×100%。 　　1.3 统计学方法 　　应用SPSS13.0软件对实验数据进行统计学分析。 　　2 结 果 　　2.1 细胞形态学变化 　　见图1。A549细胞接受放射前呈椭圆形，胞体两侧可见伪足状突起；镜下胞膜呈白色环状，界限清晰，胞质透亮，细胞核无聚集。A549/DDP细胞接受放射前呈椭圆形，但较A549细胞细长，两侧伪足状突起更细长，胞体可见较多细小突起。镜下胞膜呈白色环状，界限清晰，胞质透亮，细胞核无聚集，部分可见核仁。 A549及A549/DDP细胞接受放射后细胞形态发生变化，放射后两种细胞表现相似：镜下见两侧伪足状突起变短、变淡，细胞膜变淡，与周围界限模糊，胞质内可见粗颗粒状物，细胞