大蒜SOD的分离与提取17441.docVIP

大蒜SOD的提取与分离 第九组：赵曙光 李 娜 刘 鲁 实验目的 学习超氧物提取物的分离方法 通过大蒜细胞SOD的提取与分离 学习和掌握蛋白质和酶的提取与分离的基本原理和操作方法 实验原理 超氧化物歧化酶（SOD）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。它可催化超氧负离子（O 2-）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢。大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8磷酸缓冲液提取出。由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。 由于超氧自由基（O ）为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般为间接方法。并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O ，当加入NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲月替（黄色），继而还原生成二甲月替，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。当加入SOD时，可以使超氧自由基与H+结合生成H2O2 和O2，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲月替生成速度减慢。通过在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值，抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比，以酶液加入量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，在坐标纸上绘制出二者相关曲线，根据SOD抑制NBT光还原相对百分率计算酶活性。找出SOD抑制NBT光还原相对百分率为50％时的酶量作为一个酶活力单位（U）。 实验器材 冷冻高速离心机、可见分光光度计、研钵、玻棒、烧杯、量筒、胶头滴管、电子天平、移液管 实验药品 新鲜蒜瓣 0.05mol/L磷酸缓冲液（pH=8.2）Tris 氯仿-乙醇混合液：氯仿:无水乙醇=3:5 丙酮：用前需预冷至4-10℃ 0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH10.2） 2mmol/L邻苯三酚 实验步骤 1、组织细胞破碎：称取5g大蒜蒜瓣，置于研钵中研磨。 2、SOD的提取：破碎后的组织中加入2-3倍体积的0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8），继续研磨20min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后在5000rpm下离心15min，取上清液。 3、除杂蛋白：上清液加入0.25体积的氯仿-乙醇混合液搅拌15min，5000rpm离心15min，得到的上清液为粗酶液。 4、SOD的沉淀分离：粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，5000rpm离心15min，得SOD沉淀。将SOD沉淀溶于0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）中，于55-60℃热处理15min，得到SOD酶液。 5、SOD活力测定 将上述提取液、粗酶液和酶液分别取样，测定各自的SOD活力。 试剂 空白管 对照管 样品管 pH=8.2碳酸缓冲液(Tris) 3.0 3.0 3.0 蒸馏水 2.0 1.8 1.7 样品液 0 0 0.1 混合均匀静止 室温20min 邻苯三酚 0 0.2 0.2 加入邻苯三酚迅速混匀，准确计时4min，加一滴浓盐酸停止反应，在420nm测吸光值 实验结果 试管 空白管 对照管 样品管 吸光值 0 0.076 0.061 实验讨论 注意事项 1.酶液提取时，为了尽可能保持酶的活性，尽可能在冰浴中研磨，在低温中离心。 2.肾上腺素邻苯三酚容易被氧化，故操作时要尽量快。