考马斯亮蓝G-法测定蛋白质含量.docVIP

考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量 专业班级：制药工程 3班 小组成员：李梦娴 李敏 林晓丝 实验目的 1、了解考马斯亮蓝法测定蛋白质的原理 2、掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的操作步骤 实验原理 1、根据蛋白质的理化性质，有多种蛋白质定量方法。考马斯亮蓝G-250是比色法与色素法相结合的复合方法。考马斯亮蓝G-250是一种染料，在游离状态下呈棕红色，当与蛋白质结合后呈青蓝色。在一定范围内，也就是蛋白质含量在0~1000ug范围内，蛋白质-色素结合物在595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比，所以可用比色法测定。 2、考马斯亮蓝G-250法有常量法和微量法两种。 仪器与试剂 1、仪器：分析天平；铁架台；大漏斗；洗瓶；烧杯100ml×2、50ml×1；吸管10ml×2、5ml×1；胶头滴管；移液枪；离心管10个；722型分光光度计；容量瓶100ml×3；洗耳球×2；玻璃棒；记号笔。 2、试剂： （1）蒸馏水。 （2）标准蛋白质溶液：用移液枪吸取1ml浓度为1mg/ml标准蛋白质溶液，溶于蒸馏水并定容至10ml，制成0.1mg/ml的原液。 （3）考马斯亮蓝G-250(0.01%)染液:称取0.01g考马斯亮蓝G-250,溶于5ml 90%乙醇中，加入85%（m/v)的磷酸10ml,最后用蒸馏水定容至100ml（此溶液不宜久存，在常温中可放置1~2个月）；将定容好的染液过滤并装入棕色瓶中保存。 （4）样品液：用移液枪取1ml纯牛奶液体（经调查，市场上大部分纯牛奶中蛋白质的含量大致为每100ml中2.5~3.5g），用蒸馏水稍做稀释，然后转移至一号100ml的容量瓶中并定容至100ml;用10ml的吸量管吸取10ml一号容量瓶中的液体于二号100ml的容量瓶中，最后用蒸馏水定容至100ml，此时二号容量瓶中为待测样品液。 操作步骤 1、0~100μg/ml标准曲线的制作： 取8支离心管，编号后，按下表加入试剂，盖塞后，将各试管中的溶液纵向倒转混匀，室温静止5min后，以管一为空白对照，在595nm 下比色测定。以标准蛋白质含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 蛋白质标准液（ml） 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水（ml） 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.4 0.2 0 考马斯亮蓝染液 5 5 5 5 5 5 5 5 蛋白质含量（μg） 0 10 20 30 40 60 80 100 A595 0 0.303 0.417 0.462 0.549 0.622 0.804 0.906 2、样品中蛋白质含量测定 另取两支干净的试管（做一重复），标号A、B。分别加入1ml待测样品液体和5ml考马斯亮蓝染液，将两支试管中的溶液纵向倒转混匀，室温静止5min后，测定方法同上，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。 标号 A B 待测样品液体(ml) 1 1 考马斯亮蓝染液(ml) 5 5 A595 0.451 0.463 蛋白质含量（μg） 数据处理 1、将测得的吸光度填入上表中，并根据数值作出标准曲线。 2、计算公式：样品中的蛋白质含量（μg/g鲜重）={[查得的蛋白质含量（μg）] ×稀释倍数}/ [样品鲜重（g）] 注意事项 1、如果要求严格，最好在试剂加入后的5~20min内测定光吸收，因为这段时间内颜色是最稳定的。 2、测定中，蛋白-染料复合物会有少量吸附于比色杯壁上，不可使用石英比色皿（因不易洗去染色）。可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95% 的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。 3、若选择在漩涡器上混合，注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难以消除。 思考与讨论 1、制作标准曲线及测定样品时，为什么要将个试管中溶液纵向倒转混合？ 答：因为可以使反应充分，并且使整个反应液均一，否则在比色测定时，结果会有很大的偏差，使标准曲线的制作不标准，后续的测定结果就不可靠。 2、列举几种常用的蛋白质定量测定的方法，并于考马斯亮蓝染色法相比较各有何优缺点。 答：1.目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。 2.考马斯亮兰法的突出优点是： （1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1(g。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。 （2）测定