包虫病快速诊断试剂盒的研制.pdf

包虫病快速诊断试剂盒的研制 摘要 Echinococcosis granulosus)的幼期细粒棘球蚴寄生于人或动物体内所引起的一种重 要的人畜共患病，严重危害我国西部地区农牧民的身体健康。目前常 用的血清学诊断抗原是棘球蚴囊液，由于其成分复杂，与其他蠕虫病 患者血清有交叉反应和非特异性反应，因此假阳性问题难以克服，诊 断特异性不理想。为快速和准确地诊断细粒棘球蚴病，各国研究者一 直在寻找强特异性抗原和快速检验方法。斑点免疫金渗滤法(Dot Filtration Immunogold 的特点，是目前血清学检验中较为灵敏和快速的方法。抗原B(AgB) 被公认为是细粒棘球蚴特异性囊液抗原，占包囊液中主要抗原的90％， 并且含量稳定。目前已经发现了5个抗原B8KDa亚单位，其中 EgAgB8／2被公认为是目前最具诊断价值的特异性抗原。因此，克隆细 粒棘球蚴AgB8／2基因cDNA并进行原核表达，获得纯化抗原，将 AgB8／2抗原的特异性和斑点免疫金渗虑法的快速特点相结合研制出 特异性快速诊断试剂盒，对于囊型包虫病诊断具有重要意义。 基因cDNA片段全长335 克隆到的AgB8／2 拉圭羊源)完全一致，并且与表达载体正确连接。开放阅读框(ORF) 编码一个由90个氨基酸残基组成的蛋白质。 大小的目的蛋白，优化后的最佳表达条件为：当菌液识∞值为0．6r#， 条件下获得了可溶性融合蛋白的高表达，AgB8／2融合蛋白的表达量古 白基本去除。 隆抗体Western 合。用包虫病患者手术前血清和健康人血清分别作为一抗，Western Blot检测表明AgB8／2融合蛋白可特异性识别包虫病患者血清，而不能 识别健康人人血清。表明细粒棘球蚴AgB8／2蛋白被正确表达。 以纯化的AgB8／2融合蛋白为抗原，采用Dotblot方法检测了l份 确诊包虫病患者血清和20份健康人血清，结果纯化的重组抗原可以特 异性识别包虫病人血清，健康人血清检测假阳性率为10％。对照组全 部呈阴性。表明重组融合表达的AgB8／2具有免疫学活性，可作为特异 性抗原用于血清学检测。 根据DIGFA法检测原理，以纯化的AgB8／2融合蛋白为预包被抗 原，以预包被反应盒、硝酸纤维素(NC)膜、TBS、封闭液、显色剂 稀释液、显色剂(胶体金标记SPA)、阳性对照和阴性对照组成包虫 病快速检测试剂盒，检测了4份确诊包虫病人血清和30份健康人血 清，结果确诊包虫病人血清识别率为100％，健康人血清假阳性率为 3．33％。整个检测过程只需滴加待检血清便可在几分钟内得到检测结 果。 包虫病快速检测试剂盒的研制结合了AgB8／2抗原的特异性和 斑点免疫金渗虑法的快速特点，将在临床诊断囊型包虫病和流行病学 调查中具有广泛的应用前景，但其诊断特异性和敏感性尚需更多的确 诊病人血清验证，使其进一步完善。 关键词：包虫病，AgB8／2，DIGFA，诊断试剂盒 I玎 STUDYONARAPID DIAGNOSTICKITFOR HYDATIDOSIS ABSTRACT called Hydatidosis，also an CysticEchinococcosis(CE)，is important iscaused Echonociccinae zoonose，．whichby and granulosus damages