高效液相色谱法测定猪血清中的依维菌素.docVIP

高效液相色谱法测定猪血清中的依维菌素 　　猪血又称液体肉、血豆腐和血花等，味甘、苦，性温，有解毒清肠、补血美容的功效。猪血富含维生素B2、维生素C、蛋白质、铁、磷、钙、尼克酸等营养成分。 　　建立猪血清中依维菌素(ivermectin)的高效液相色谱测定方法。方法：以0。05 偏磷酸-甲醇(7：3)沉淀猪血清蛋白后用乙酸乙酯提取依维菌素，离心后取上清液用旋转真空蒸发器挥干溶剂，用甲醇溶解残渣后进样分析。色谱柱为反相柱(5μm，250mm×4.6mm)，流动相为甲醇-水(90：10)，流速1ml/min，紫外检测波长为245nm 结果方法检出下限为0.010mg/L，线性范围为0.010～20mg/L，相对标准差为0.78%～3.82%，加标回收率为94.0%～100.O%。结论本法操作简便，结果准确可靠，适用于猪血清中微量依维菌素的测定。 　　「关键词」高效液相色谱法;猪血清;依维菌素 　　依维菌素是一种新型高效广谱抗寄生虫药，对线虫、昆虫和螨虫等均有驱杀作用，可用于防治家畜和宠物的寄生虫病。其在体内有一定的蓄积性，人食用了这些家畜肉制品后，依维菌素会对人体健康产生危害。因此，需测定动物血清中依维菌素的含量。对于基体简单的样品如药片和注射液中依维菌素含量的测定可用紫外分光光度法和高效液相色谱法。血清样品基体复杂，干扰成分多，其测定相对困难，国外已有荧光衍生-HPLC法的报道，该法灵敏度高，但衍生化步骤繁琐，分析成本较高。本研究利用0.05%偏磷酸-甲醇(7：3，V/V)沉淀血清蛋白、乙酸乙酯提取其中微量依维菌素，高效液相色谱法测定含量，取得了较为满意的结果。 　　1 材料与方法 　　1。1 主要试剂及仪器 　　甲醇(色谱纯);乙酸乙酯(分析纯);偏磷酸(分析纯);依维菌素标准储备液：准确称取0.0500g依维菌素(中国兽药监察所提供，批号KY31297)于25ml容量瓶中，加甲醇溶解定容，此液质量浓度为2.00mg/ml。临用前，用甲醇稀释成应用液。本实验用水均为纯水。 　　液相色谱仪;反相色谱柱：5μm，250mm×4.6mm;色谱保护柱;紫外可见分光光度计;离心机;旋转真空蒸发器。 　　1。2 实验方法 　　1。2。1 色谱条件 流动相：甲醇-水(90：1O)，流速1ml/min，柱温25℃，反相C18色谱柱(5μm，250mm×4.6mm)分离，紫外检测波长为245nm。 　　1。2。2 标准曲线绘制 取依维菌素标准应用液用甲醇稀释成0.10mg/L，0.25mg/L，0.50mg/L，1.O0mg/L，2.50mg/L，在仪器基线达到平直后，分别进样20μl。依维菌素保留时间为17.0min左右。以进样量(X，ng)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，计算线性回归方程。本标准曲线回归方程为Y=1.75X一0.12，r=0.9994。 　　1。2。3 样品处理及测定 取猪血清1.00ml置于10ml离心管中，加0.05%偏磷酸-甲醇(7：3，V/V)1.00ml，漩涡混匀，加4.00ml乙酸乙酯振摇200次提取，4000r/min离心5min。吸取乙酸乙酯层3.O0 ml于10ml离心管中，于40℃水浴下用旋转真空蒸发器挥干。加0.20ml甲醇旋涡振荡1min并超声1min溶解，4000 r/min离心5min后取上清液进样100μl。 　　2 结果与讨论 　　2。1 色谱条件的优化 　　2。1。1 检测波长的选择 在200nm～400nm范围内，用UV-260紫外可见分光光度计对依维菌素进行紫外扫描，其在245nm及238nm均有峰值吸收，本法选择245nm为检测波长。 　　2。1。2 流动相中甲醇比例的选择 改变流动相中甲醇与水的比例，观察保留时间及峰形的变化。实验结果表明，流动相中甲醇含量对依维菌素保留时间影响较大。甲醇含量从100%变化为90%时，保留时间从4.9min变化为17.0 min。17.0min时可将依维菌素与血清中杂质基本分离。所以，本法选用甲醇-水(90：10)为流动相。 　　2。1。3 柱温的选择 柱温影响待测物质与流动相、固定相之间的分配、吸附，也影响流动相的粘度，进 　　而影响保留时间和峰形。比较了柱温为20℃、25℃、30℃时的依维菌素的出峰时间及峰形，结果无明显差别。本法选用柱温为25℃。 　　2。2 样品提取条件的优化 　　2。2。1 提取溶剂的选择 从依维菌素的分子式可以看出它是相对分子质量大、极性小的化合物，应选用极性小的有机溶剂进行提取。实验结果表明，在相同的条件下，乙酸乙酯的提取效率为94.3%;二氯甲烷的提取效率为26.7%。正己烷、乙醚的提取效率为74.0%。故选用乙酸乙酯作为提取剂。2.00ml乙酸乙