间充质干细胞对去除CD4-%27%2b-CD25-%27%2b-调节性T细胞哮喘小鼠气道炎症影响.pdfVIP

◇中山火警 间充质干细胞对去除cD4+CD25+调节性T细胞哮喘小鼠气道炎症的影响 鼠气道炎症的影响 中山大学附属二院呼吸内科 学位申请人：张炜 导师：李建国教授 摘要 研究背景 支气管哮喘是以气流可逆性阻塞和慢性气道炎症为特点的疾病。支气管哮喘 的发病机制复杂，最重要的免疫学异常是Thl／Th2类细胞因子失衡，但哮喘 Thl／Th2失衡仅是表象，哮喘患者对过敏原的免疫耐受机制存在缺陷才是导致 T Thl／Th2失衡的重要原因。调节性T细胞(Regulatory 巴细胞的一个亚群，由Sakaguchi等首先描述，是天然存在的Treg，又称胸腺源 外周耐受的重要细胞。越来越多的证据表明，Treg与哮喘变态反应性炎症有着密 切的关系。 Stem Cells，MSCs)在特定的诱导条件 骨髓间充质干细胞(Mesenchymal 下具有向成骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞等间质细胞分化的能力。研究表明， MSCs除多向分化潜能外，还具有免疫调节作用。MSCs不表达主要组织相容性 CD40L，MSCs不易被宿主免疫细胞识别，并能逃避免疫系统的免疫排斥。异基 因MSCs不但可以进入受体的免疫器官，而且可在体内较长期存在。因此，MSCs 改善哮喘小鼠气道炎症，具有治疗哮喘的潜在临床应用前景，目前尚未见报道。 我们将体外扩增的MSCs植入哮喘小鼠体内，观察MSCs对哮喘小鼠外周血 诵中山火謦 间充质干细胞对去除cD4+CD25+调节性T细胞哮喘小鼠气道炎症的影响 炎症的变化以及骨髓间充质干细胞对去除CD4+CD25+Treg哮喘小鼠气道炎症的 影响，探讨MSCs减轻哮喘小鼠气道炎症的可能机制。 研究目的 第一章 建立一种从小鼠骨髓中分离培养间充质干细胞(MSCs)的高效方 法，并在体外进行传代扩增和鉴定。 道炎症中的作用。 试验方法 1、小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定 1．1体外分离、培养小鼠骨髓来源的MSCs 取出股骨和胫骨，以DMEM／F12培养基冲出骨髓，完全培养基重悬，接种致25cm2 塑料培养瓶，置于37。C、5％C02、饱和湿度培养箱中培养。6天后首次换液去 除未贴壁细胞，以后每天换液，细胞达90％融合时传代。 1．2小鼠骨髓MSCs的鉴定 第5代MSCs接近融合时进行成骨和脂肪细胞诱导分化。 2、间充质干细胞对去除CD4+CD25+调节性T细胞哮喘小鼠气道炎症的影响 2．1哮喘模型的制备 将健康六周龄SPF级雌性BALB／e小鼠40只，随机分为5组，每组8只， 分别为正常对照组(A组)，哮喘模型组(B组)，去除Treg细胞哮喘模型组(C 溶液雾化吸入激发建立小鼠哮喘模型，A组以生理盐水代替OVA。 2．2小鼠体内去除Treg细胞模型的制备 C组和E组小鼠在激发前1天尾静脉注射0．25mg大鼠抗小鼠CD25+单克隆 抗体，并在激发试验第三天强化注射0．25mg大鼠抗小鼠CD25+单克隆抗体，维 持Treg细胞低水平。 2．3MSCs处理组 U ‘》中-1．，o警 间充质干细胞对去除cD4+CD25+调节性T细胞哮喘小鼠气道炎症的影响 D组与E组在诱导哮喘的第14天、20天尾静脉分别注入0．2ml浓度调整为 X 1．5 106／ml的MSCs，其余三组经尾静脉注入等量PBS。 2．4试验项目 流式细胞术检测外周血CD4+CD25+Treg占淋巴细胞的比例，检测小鼠支气 管肺泡灌洗液(BALF)中自细胞总数、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞 计数，结合病理切片分析气道炎症情况。 统计学方法 实验数据采用SPSSl3．0软件进行统计分析，病理评分采用中位数表示，组 间比较采用秩和检验。其余各组数据以均数土标准差表示。组间样本均数比较采 用单因素方差分析(One．WayANOVA)，方差分析先行方差齐性检验，方差不齐 进行平方根转换，用LS