养殖刺参腐皮综合征2种致病菌间接荧光抗体快速检测方法.pdfVIP

第 17卷第2期 中国水产科学 V01．17 No．2 2010年 3月 JournalofFisherySciencesofChina March 2010 养殖刺参腐皮综合征2种致病菌间接荧光抗体快速检测方法 王印庚 ，谢建军2，荣小军 ，廖梅杰 ，张正 (1．中国水产科学研究院 黄海水产研究所，青岛市海水鱼类种子T程与生物技术重点实验室，山东 青岛 266071；2．浙江省海 洋水产研究所，浙江 舟山 316100) 摘要 ：以养殖刺参(Apostichopusjaponicus)腐皮综合征 的2种致病菌：灿烂弧菌(Vibriosplendidus)和假交替单胞菌 (Pseudoaheromonasnigrifaciens)为抗原 ，分别制备兔抗血清。以载玻片为介质 ，建立了2种病原菌的间接荧光抗体检测 技术 (IFATo交叉反应 、阻断试验和吸收试验结果均表明本方法特异性强。对人工感染实验 巾的养殖水体及发病刺参 溃烂组织检测 ，可以检出水体和患病刺参溃烂组织中的相应病原菌，病原菌被染成明亮的黄绿色 ，检测灵敏度2．4X104 cellm／L。冰冻切片检测结果显示 ，在刺参肿胀嘴部与溃烂肌肉处有大量染成黄绿色的细菌颗粒。结果表明：采用 IFAT 可以对刺参腐皮综合征2种致病菌进行准确快速的检测。该方法的建立对刺参腐皮综合征的流行病学调查及快速诊断 具有重要意义。 『巾国水产科学，2010，17(2)：329—336] 关键词：刺参；腐皮综合征；灿烂弧菌 ；假交替单胞菌；间接荧光抗体检测 (IFAT) 中图分类号：$94 文献标识码 ：A 文章编号：1005—8737一(2010)02—0329～08 21世纪初 ，刺参 (Apostichopusjaponicus)养殖在 (Pseudoalteromonasnigrifacien$)2种菌均为该病 的 中国北方沿海蓬勃兴起，并迅速发展成为中国最重 致病原 (图版I—B、Co 要的海水养殖种类之一。2008年中国养殖刺参总 目前应用于水产动物疾病快速检测的方法主 面积达 64386hm ，年总产量 775171…，产生了巨 要有：细菌 自动鉴定系统、酶联免疫检测，免疫荧光 大的经济效益和社会效益。由于刺参养殖规模的迅 抗体技术，PCR检测等 。近2年 已有Dot．ELISA 速扩张，病害防治等配套技术相对滞后，加之生产过 和核酸探针检测 检测技术应用于海参疾病检测， 程 巾的不规范操作，导致病害问题 日趋严重，2003年 其 中核酸探针检测灵敏度较高但是技术难度较大， 至 2006年，整个北方沿海刺参养殖业由于病害暴发 Dot．ELISA则操作简便结果直观，但是较难进行定 造成巨大经济损失。疾病种类多种多样，其中以刺 量检测，由于免疫荧光抗体检测可以直接显示抗原 参 “腐皮综合征”的危害最：为严重。该病波及面广， 形态，进行抗原定位，而且灵敏度较高，在快速检测 传染性强，死亡率常高达90％，造成经济损失惨重， 技术 中有其独特优势，已经广泛应用于水产动物疾 是导致 中国刺参大面积死亡的最重要疾病 [21o刺 病的临床诊断 17-9]o由于一般进行细菌病原的检测 参腐皮综合征的发病症状表现为：摇头、口部肿大、 需要先完成细菌培养，然后进行检测，检测时间相对 排脏、身体萎缩、口部溃烂、体表大面积溃疡直至溶 较长，本研究利用间接荧光抗体检测技术 (Indirect 解死亡 (图版I—A)。王印庚等 和张春云等 FluorescentAntibodyTechnique，IFAT)对刺参腐皮 报道灿烂弧菌 (Vibriosplendidus)和假交替单胞菌 综合征2种主要病原菌进行检测和分析，尝试对人 收稿 日期：2009～04—16；修订 日期：2009—12—08． 基金项 目：国家863计划项目(2006AA100313)；山东省科技发展计划项目(2004GG2205116)；青岛科技发展计划项目(02—1一kchh