重组Kinectin蛋白表达及纯化.pdfVIP

重组Kinectin 蛋白的表达及纯化1 1 2 1 1 3 1 1 1 黄天明 ，黄绍明 ，莫发荣 ，何少健 ，周素芳 ，闫磊 ，谢小薰 ，罗国容 1 广西医科大学组织与胚胎学教研室，南宁（530021 ） 2 广西医科大学解剖学教研室，南宁（530021 ） 3 广西医科大学生物化学教研室，南宁（530021 ） E-mail ：tianminghuang@ 摘 要：目的：探讨重组kinectin 蛋白的诱导表达及纯化条件。方法：以pMAL-C2 为载体 构建重组质粒，并转入TB1 宿主菌。通过不同的诱导温度、诱导时间、IPTG 浓度以及IPTG 加入时机对 TB1 工程菌进行诱导比较，探讨较理想的诱导表达条件。诱导产物过 Amylose-resin 亲和层析柱进行纯化。结果：TB1 工程菌在37℃振荡培养2 个小时后加入终 浓度为0.5mmol/L 的IPTG ，降低温度到34℃继续诱导3 个小时，可获得理想诱导效果；诱 导产物经过柱纯化后，可获得较纯的MBP-kinectin 融合蛋白。结论：pMAL-C2 载体可用于 kinectin 的体外基因重组表达；通过对诱导及过柱条件的优化，可获得较高的MBP-kinectin 融合蛋白表达效率及纯度。 关键词：肿瘤抗原；kinectin；基因重组；蛋白表达；纯化 中图分类号：R735.7 文献标识码 A 1. 引 言 肝细胞癌（ＨＣＣ）是死亡率很高的一种恶性肿瘤，目前其诊疗仍缺乏特异性，寻找 HCC 相关抗原是当前 HCC 防治研究的一个迫切任务。本课题组应用 SEREX （serological analysis of recombinant cDNA expression libraries ）技术，从广西人HCC 的cDNA 文库中筛 选出了一系列HCC 相关的抗原基因 [1,2] ，其中编号为HCC-27-9-3 的基因序列与kinectin 的 [3] N 末端同源，且初步检测表明，其抗体在HCC 病人中有较高的特异性和阳性率 。本研究 在对此kinectin 蛋白进行了体外重组、克隆及表达的基础上[4]对其诱导及纯化条件进行了优 化，为其开发应用奠定了基础。 2. 材料与方法 2.1 材料: HCC-27-9-3 重组噬菌粒为本室自存；大肠杆菌DH5α和TB1、质粒pMAL-C2 、 Amylose resin 亲和层析填料均为New England Biolabs 公司产品；IPTG 为北京夏斯生物公司 产品；X-gal 、Taq 酶、dNTP、BamHI 、HindIII和低分子量标准蛋白均为Fermentas 公司产品； XmnI为Promega 公司产品；T4DNA 连接酶为MBI 公司产品；小分子量胶回收试剂盒购自 上海华舜生物工程公司； DNA marker 购自北京鼎国生物工程公司；PEG8000 为BBI 公司 产品；其余化学试剂均为国产分析纯。SDS由3%浓缩胶和12%分离胶组成，凝胶中 蛋白的定量分析软件为BIO-RAD 公司的Quantity One 凝胶分析软件；引物均由上海生工合 成；蛋白的飞行质谱测序分析送复旦大学进行。 2.2 方法 2.2.1 重组质粒的构建及鉴定： 1本课题得到国家自然科学基金（编号）、高校博点专项基金（编号：20050598006 ）和广西科 技厅基金（编号：0542068 ）的资助。 - 1 - 将用PCR 扩增的HCC-27-9-3 重组噬菌粒中的kinectin 目的基因片断插入