【分析化学】肿瘤细胞耐药行为研究及Bax蛋白的检测.pdfVIP

分类号 密级 学校代码 肿瘤细胞耐药行为研究及Bax蛋白的检测 Studieson behavioroftumor drug——resistant cellsanddetectionofBax protein 研 究 生 姓 名 徐丽丽 指导教师姓名职称 谭亮教授 学 科 专 业 分析化学 研 究 方 向 生化分析与生物传感 湖南师范大学学位评定委员会办公室 二零一三年六月 中文摘要 恶性肿瘤是人类最致命的疾病之一，化疗是一种常见的治疗手 段。然而，化疗经常会导致肿瘤细胞出现耐药性，这是致使化疗失败 的重要原因之一。一般认为，肿瘤细胞耐药主要受蛋白介导的药物外 排泵机制、酶介导机制和凋亡调控基因介导机制等控制。肿瘤细胞表 面Bax等促凋亡蛋白的正常表达可以促进细胞凋亡而抑制其过度生 长，其表达水平的下调与肿瘤细胞的耐药性有密切关系，Bax蛋白的 检测在医学和细胞生物学上有重要意义。本论文主要以体外培养的肿 瘤细胞为研究对象，利用MTT比色分析、．电化学方法和酶联免疫分 析法，研究了粘附分子介导的肿瘤耐药行为，并对肿瘤细胞和耐药肿 瘤细胞表面的Bax蛋白表达进行了检测。主要内容如下： 1．采用MTT法研究了人骨肉瘤细胞(MG．63)在胞外基质纤维粘连 蛋白(FN)上的粘附及对药物5．氟尿嘧啶(5一FU)敏感性的影响。 与粘附在未修饰FN的基底上的MG-63细胞相比，粘附在FN上的 细胞凋亡率明显降低，对药物的耐受程度加强。抗整合素B1抗体 (anti．CD29 mAb)部分阻断细胞与FN的连接后，肿瘤细胞恢复 了对药物的敏感性，说明肿瘤细胞耐药与细胞的粘附行为有密切关 系。荧光显微镜的观察实验验证了MTT分析结果的准确性。 2．利用电化学竞争免疫分析法定量检测了肿瘤细胞表面的Bax蛋白。 将Bax蛋白和辣根过氧化物酶(阳姆)组装到硫堇．石墨烯(TH．GN) T 修饰的电极表面构建电化学生物传感器。Bax抗体与抗原的结合引 起空问位阻效应，导致传感器的电化学响应降低。当抗体组装过 程中存在肿瘤细胞或Bax抗原时，由于竞争反应上述效应减弱。 最佳检测条件下，差分脉冲伏安法(DPV)得到峰电流的变化程 cells 度与细胞浓度在2．5×103到1．6×105mL。1范围内成正比，检测 cells 限为800 证明Bax蛋白的降低是导致肿瘤细胞耐药的一个重要原因。 3．采用酶联免疫分析法(ELISA)检测了肿瘤细胞表面Bax蛋白的 表达水平。制备了辣根过氧化物酶一纳米金一Bax抗体复合物 (ⅧⅫ．Au NPs．Ab)并用于结合细胞表面的Bax蛋白。HRP催化 过氧化氢(H202)对3，3’，5，5’．四甲基联苯胺(TMB)的氧化， 产生深蓝色的双偶氮联苯胺化合物。酶标仪检测结果表明，最佳 cells 检测条件下，光密度(0D)与细胞浓度在2．5×103到4．0×104 mL‘1范围内呈良好的线性关系。相对于接种MCF一7／ADR的孔， 接种MCF．7的孔具有更高的OD值，表明耐药肿瘤细胞表面Bax 蛋白表达水平较低。 关键词：肿瘤细胞，耐药，细胞粘附分子，Bax蛋白，MTT比色法， 电化学检测，ELISA分析 ABSTRAC