蛋白质印迹聚合物富集天然微量pBiP及对pBiP基因序列研究.pdfVIP

摘要 摘要 本文分为两个部分：第一部分是用蛋白质印迹聚合物富集天然微量蛋白 pBiP的研究；第二部分是用PCR方法阐明编码猪内质网体中BiP的片段基因的 研究。 第一部分研究工作是基于本组蛋白质印迹技术的研究成果，制各新型的印 迹聚合物来分离纯化天然蛋白质。近年来，许多研学究者开展了以蛋白质为模 板的分子印迹聚合物的研究，也期望该技术能够成为分离纯化蛋白的一种重要 手段。但是目前能作为模板的蛋白质都是常见的一些在细胞中含量很高的蛋白， 而在高等生命体中绝大多数蛋白质在细胞中的含量是非常微小的，因而对天然 微量蛋白的纯化研究是非常有必要的。本组前期的研究工作在识别体系中引入 了限长的辅助识别聚合物链(ARPCs)，提高了识别目标蛋白的专一性，取得了 很好的富集效果。 在本工作中，我们引入的ARPCs上带有随机分布的羧基与吡啶双重识别基 团以及锚定基团侧链并以在大肠杆菌中克隆表达的鼠免疫球蛋白重链结合蛋白 接枝的大孔树脂微球作为固相载体，将复合物组装体与第二单体丙烯酰胺在水 相中进行交联聚合反应，洗脱掉模板蛋白后就得到了蛋白质印迹聚合物。我们 利用该蛋白质印迹聚合物对天然猪内质网体(ER)提取物进行吸附，结果发现 在吸附后的洗脱液中目标蛋白pBiP的浓度达到了1)．15ng／gL，与吸附前的ER 提取液相比，目标蛋白在总蛋白质中的含量被富集了约56倍，再生印迹聚合物 仍具有优良的识别与亲和性能。说明这种印迹聚合物对天然微量蛋白有良好的 特异识别性并且可以循环使用。这是我组首次采用蛋白质分子印迹聚合物的方 法分离富集高分子量的天然微量蛋白质，结合本组关于印迹聚合物在小分子量 天然蛋白分离方面的研究成果，表明我们的方法具j阿一定的普适性。 第二部分的研究工作是用PCR方法阐明编码猪内质网体中pBiP的片段基因 序列的研究。pBiP参与进入内质网体的分泌型蛋白与膜蛋白的折叠、贮存和转 运，我们希望通过以克隆的pBiP为模板合成印迹聚合物来吸附ER提取物中天 然的pBiP，已达到富集纯化天然pBiP蛋白的目的，进而对天然pBiP的生物学 功能进行研究。 摘要 由于pBiP的序列尚未报道，我们根据已知物种BjP序列的同源性分析，设 计引物，进行PCR，得到了猪BiP的中间序列，为进一步研究猪BiP的5·端和 3’端序列以及猪BiPcDNA序列奠定了基础。 关键词：克隆免疫球蛋A重链结合蛋白(BiP)模板，辅助识别聚合物链(ARPCs)， 蛋白质印迹聚合物，猪内质网体，PCR Abs仃act Abstract Thisdissertationconsistsoftwo first the partinvestigatedseparation parts：the andenrichmentofactivenaturallowcontent imprintedpolymer pBiPusingprotein focusedon ofBiP secondofthisdissertation cloning fragmentgene (PIP)；the part fromER PCR． pig using Basedon researchofour new ofPIPwas to previous laboratory,atype prepared and the inthefirst recent researchersare protein part．In years，many separatepunfy