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第十四章 动植物细胞培养 动植物细胞培养是指动、植物细胞在体外条件下的存活或生长。动植物细胞培养与微生pH值、溶氧、C02温度、剪切应力都比微生物有更在生物技术中，人们已经利用细菌、丝状真菌的大量培养来生产各种酶、抗生素、蛋白20世纪50年代 表14-1 动植物、微生物细胞的培养特征 种类 比较项目 微生物 动物细胞 植物细胞 大 小 悬浮生长 营养要求 生长速率 代谢调节 环境敏感 细胞分化 剪切应力敏感 传统变异，筛选技术 细胞或产物浓度 1~10μm 可以 简单 快，倍增时间0.5~5小时 内部 不敏感 无 低 广泛使用 较高 10~100μm 多数细胞需附着表面才能生长 非常复杂 慢，倍增时间15~100小时 内部、激素 非常敏感 有 非常高 不常使用 低 10~100μm 可以，但易结团，无单个细胞 较复杂 慢，倍增时间24~74小时 内部、激素 能忍受广泛范围 有 高 有时使用 低 第一节 动物细胞大规模培养技术 动物细胞体外培养的历史可追溯到1907年，美国生物学家Harrison在无菌条件下，以淋巴液为培养基成功地在试管中培养了蛙胚神经组织达数周，创立了体外组织培养法。1962年，其规模开始扩大，随着细胞生物学、培养系统及培养方法等领域的不断丰富和完善，动物细胞培养技术得到了很大的发展。发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物高技术产业的重要部分。其发展简史见表14-2。 利用动物细胞培养技术生产的生物制品已占世界生物高技术产品市场份额的50%。大量资料表明，生物技术药物是当前新药开发的重要领域，生物技术制药工业是下一个10年制药工业的重要新门类，期间将有数百种生物技术新药上市。美国最新预测几种畅销基因工程药物2000年全球销售额EPO大于30亿美元,G2CSF大于20亿美元,HGH、IFN、UK均大于10亿美元,胰岛素和降钙素大于5亿美元。动物细胞大规模培养技术是生物技术制药中非常重要的环节。目前,动物细胞大规模培养技术水平的提高主要集中在培养规模的进一步扩大、优化细胞培养环境、改变细胞特性、提高产品的产率与保证其质量上。 表14-2 动物细胞培养技术的发展 年份 技术发展概要 1907年 1951年 1957年 1962年 1967年 1975年 1975年 1986年 1989 Harrison创立体外组织培养法。 Earle等开发了能促进动物细胞体外培养的培养基。 Graff用灌注培养法创造了悬浮细胞培养史上绝无仅有的1×1010～2×1010 cells/L的记录，标志着现代灌注概念的诞生。 Capstile成功地大规模悬浮培养小鼠肾细胞 BHK ，标志着动物细胞大规模培养技术的起步。 Van Wezel用DEAE-Sephadex A 50 为载体培养动物细胞获得成功。 Sato等在培养基中用激素代替血清使垂体细胞株GH3在无血清介质中生长获得成功，预示着无血清培养技术的诱人前景。 Kobhler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。 DemoBiotech公司首次用微囊化技术大规模培养杂交瘤细胞生产单抗获得成功。 Konstantinovti首次提出大规模细胞培养过程中的生理状态控制，更新了传统细胞培养工艺中优化控制之理论 一、动物细胞形态 1 成纤维细胞型 fibrlblast或mechanocyte type 这种细胞形态与体内成纤维细胞形2～3个长[如图-l a ]。除真正的纤维细胞外，凡由中胚层间充质来源的其他组织细胞，如血管内皮、 2 上皮细胞型 epithilium cell type 这种细胞呈扁平的不规则三角形，中央有圆形[如图14-1 b ]，起源于外胚层和内胚层组织的细 汗腺、皮脂腺等 。肠管上皮、肝、胰和肺泡上皮细胞。培养时 3 游走细胞型 wondering cell type 这种细胞的培养需要在支持物上生长，一般不[如图14-1 c ]。此型细胞不很稳定，有时亦难和其他型细胞相区别，在一定条件下，如 4 多形性细胞型 polymorphic cell type 除上述三种细胞外，还有一些组织和细胞，[如图14-1 d ]。 上述这四种细胞形态均属于贴壁依赖型细胞，培养这类细胞时，常需贴附在支持物上生 5 悬浮型细胞这类细胞常呈圆形，不贴附在支持物上，呈现悬浮状态生长。如血液1、培养基的组成 图14-1动物细胞形态 （a）成纤维细胞型上皮细胞型游走细胞型多形性细胞型Eagle基本培养基和更复杂的 1 氨基酸必需氨基酸是动物细胞本身不能合成的，