茶树冷驯化过程中基因表达差异的初步分析.pdfVIP

茶树冷驯化过程中基因表达差异的初步分析 1、2 2 2* 1* 梅菊芬 王新超 ，杨亚军 ，黎星辉 1 南京农业大学茶叶科学研究所，江苏南京 (210095) 2 中国农业科学院茶叶研究所/农业部茶叶化学工程重点实验室，浙江杭州 (310008) E-mail: meijufen@ 摘 要：采用mRNA差别显示的方法对茶树冷驯化过程中基因差异表达进行了初步研究，从 58条差异片段得到稳定扩增的差异片段23条，用RT-PCR的方法鉴定其假阳性，得到5个 阳性片段，其中3个片段在冷驯化过程中表达量增加，另外2个片段的表达量降低。经过 BLAST比对分析，其中一个片段序列与高粱反式玉米素-O-葡糖基转移酶同源性较高；一个 与黄瓜叶绿体合成相关蛋白基因同源性较高；一个为茶树核酮糖-1,5-双磷酸羧化酶/加氧酶 小亚基基因片段；一个与细胞色素b亚基有较高同源性；还有两个片段序列比对没有同源序 列，可能为新基因。 关键词：茶树；冷驯化；基因表达差异；特异片段 中图分类号：S571.1 茶树（Camellia sinensis）原产于热带及亚热带，是一种喜温暖气候条件的叶用植物。 随着人们对茶叶需求量的增加，茶树种植范围的不断扩大，茶树种植区域逐渐北移；另一方 面，随着近几年全球气温变化的不稳定性，预防气温特别是低温给茶树生长可能造成的伤害， 也愈来愈显示出其重要性。怎样提高茶树的抗寒性，已日益引起人们的高度重视。茶树抗寒 性是茶树长期适应低温胁迫过程中逐步发展形成的一种对寒害的抵抗能力，其中伴随着一系 列可遗传的形态和生理生化特性的变化。不同的茶树品种对低温胁迫表现出不同的适应能 力。研究茶树的抗寒性，对茶树种质资源的开发利用和茶树的引种以及寻求提高茶树抗寒性 栽培技术等都具有十分重要的理论和实践意义。 现有研究结果表明，茶树的抗寒性需要通过一定时间和程度的低温驯化才能体现出来， 在经过冷驯化之后，茶树在形态结构、生理生化如叶片栅栏组织厚度，保护性酶类，生物膜 透性，水分，糖类及可溶性蛋白等方面发生一定的适应性变化，从而能够忍受一定程度低温 胁迫的影响[1,2,3] 。日益增加的研究表明，在植物冷驯化过程中所发生的一系列变化是通过低 温改变基因表达而引起的，并克隆了许多抗寒相关的基因[4,5] 。而在茶树上，关于冷驯化过 程中基因表达情况的变化尚未发现相关研究。对于茶树而言，研究茶树冷驯化过程中的基因 表达变化，不仅能够从理论上揭示茶树抗寒的分子本质，而且有可能发现与抗寒性密切相关 的分子标记，从而为今后利用分子标记进行茶树抗寒性鉴定提供支撑。 mRNA 差别显示技术（DDRT-PCR ）是Liang 和 Pardee[6]发明的一种分离编码产物未知 基因的一种快速而有效的方法，具有操作简便快捷灵敏度高，RNA 用量少并可同时比较多 本课题得到教育部高等学校博士点专项科研基金（项目编号：20060307024 ）；浙江省自然科学基金 （Y304448 ）部分资助和江苏省高技术计划项目（BG2003301）的资助。 *共同通讯作者 1 个样品的特点，在分离克隆发育相关基因、抗逆基因、调控基因、突变基因等方面得到广泛 的应用[7] 。 目前细胞膜透性的变化，已作为一个抗寒性的指标被大家所普遍接受。用电导法测定膜 透性的变化，来判断植物的抗寒性大小，也成为一个比较可靠的方法[8] 。本文先以电导率为 指标研究了冷驯化过程中茶树抗寒性的变化，并选择几个重要的拐点，利用DDRT-PCR技术 初步研究茶树冷驯化过程中基因的差异表达情况，希望从分子水平为茶树冷驯化过程中抗寒 力的变化机制提供一些证据，为以后克隆茶树抗寒基因及其分子生理研究奠定一定的基础。 1 材料与方法 1.1 实验材料 实验材料为取自中国农业科学院茶叶研究所国家茶树种质资源圃的龙井 43 的叶片，从 2005 年 10 月 21 日开始，到翌年3 月 21