从RNA 提取到荧光定量PCR 完整解决方案.pdfVIP

TIANGEN 2008 全国巡回分子生物学培训班全国巡回分子生物学培训班 全国巡回分子生物学培训班全国巡回分子生物学培训班 ——从从 RNA 提取到荧光定量提取到荧光定量 PCR 完整解决方案完整解决方案 从从 提取到荧光定量提取到荧光定量 完整解决方案完整解决方案 实验实验操作流程操作流程 实验实验操作流程操作流程 2008 年制年制 年年制制 第一部分第一部分：大鼠肝脏：大鼠肝脏RNA 提取提取与验证与验证 第一部分第一部分：：大鼠肝脏大鼠肝脏 提取提取与验证与验证 实验准备实验准备：： 实验准备实验准备：： 材 料：大鼠肝脏 试 剂 盒：RNAprep pure 动物组织总RNA 提取试剂盒 （DP431） 相关试剂：β-巯基乙醇；无水乙醇；琼脂糖；5×TBE 电泳液 （或50×TAE ）；RNA loading buffer；EB 染料。 耗 材：1.5ml RNase-free 离心管；RNase-free 枪头 （1000、200、10ul）；乳胶手套；口罩；marker 笔； 签字笔。 工具仪器：镊子；剪刀；RNA 专用移液枪 （1000，200，20，10ul）；离心管架；timer ；浮漂；水浴锅；涡 旋仪；高速离心机；紫外分光光度计；凝胶成像仪；通风厨等。 配胶所需工具：天平；微波炉；三角瓶；RNA 专用的电泳仪、电泳槽、梳子、制胶版。 相关溶液配制相关溶液配制：： 相关溶液配制相关溶液配制：： 1．操作前在RL 中加入β-巯基乙醇至终浓度1%，如1 ml RL 中加入10 l β-巯基乙醇。 2 ．取60ml 无水乙醇加入到漂洗液RW 中。 3．DNase I 储存液的配制：将DNase I 干粉 （1500 U）溶解在550 l RNase-free ddH O 中，轻柔混匀。 2 操作步骤操作步骤：： 操作步骤操作步骤：： 1．匀浆处理： 取20 mg 大鼠肝脏加300 l 裂解液RL （使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇），用研磨杵将组织彻 底研磨；随后向匀浆液中加入590l RNase-free ddH O 和10 l 蛋白酶K，混匀后56 ℃处理15 分钟。 2 2 ． 12,000 rpm(~13,400×g)离心5 分钟，取上清进行以下操作 （约800ul ）。 3． 缓慢加入 0.5 倍上清体积无水乙醇 （约400ul ），混匀 （此时可能会出现沉淀），得到的溶液和沉淀分 2 次转入吸附柱CR3 中（吸附柱放在收集管中）， 12,000 rpm(~13,400×g)离心60 秒，弃掉收集管中的 废液，将吸附柱放回收集管中。 4 ． 向吸附柱CR3 中加入350 l 去蛋白液RW1，12,000 rpm(~13,400×g)离心60 秒，弃废液，将吸附柱 放回收集管中。 5． DNase I 工作液的配制：取10 l DNase I 储存液放入新的RNase-free 离心管中，加入70 l RDD 溶 液，轻柔混匀。 6 ． 向吸附柱CR3 中央加入80 l 的DNase I 工作液，室温放置15 分钟。 7． 向吸附柱CR3 中加入350 l 去蛋白液RW1，12,000 rpm(~13,400×g)离心60 秒，弃废液，将吸附柱 放回收集管中。 8 ． 向吸附柱CR3 中加入500 l 漂洗液RW （使用前请先检查是否已加入乙醇使用前请先检查是否已加入乙醇），室温静置2 分钟，12,000 使用前请先检查是否已加入乙醇使用前请先检查是否已加入乙醇 rpm(~13