采用cMasterRTplusPCR系统提高RT-PCR的灵敏度和产物长度.pdfVIP

文 献 参 考 采用 cMaster RTplusPCR 系统 提高 RT －PCR 的灵敏度和产物长度 摘要 简介 RT－PCR 已经成为研究者确定感兴 逆转录（RT）以及随后进行的 PCR（RT－PCR）是 RNA 分析中使用得最广 趣的器官、组织或细胞中 mRNA 转录 泛的技术之一。如果需要平行分析多个 RNA 样品，首选方法为一步法 RT－PCR。 本出现、结构和表达水平的基本方法。 如果要扩增困难目标片段或从单一 cDNA 池中扩增多重目标片段则会选择两步法。 RT－PCR 的基本步骤包括：首先对样 Eppendorf 推出的全新的 cMaster RTplus PCR 系统适用于各种 RT－PCR 应 品中出现的所有 mRNA 合成一个 cDNA 用。它含有一种全新的重组逆转录酶和一种具有高保真性的 PCR 酶混合物。另 拷贝，接着扩增感兴趣的基因。因为两 外，RTplus PCR 反应缓冲液能够自动调节镁离子浓度，因此这一重要成分的浓度 个步骤中使用的反应缓冲液不能兼容， 无需优化。这种自我调节的效果是通过对镁离子的弱螯合作用来实现的。如果镁 所以这两个步骤（RT 和 PCR）通常分 Taq 离子浓度过高，螯合剂会与过剩的镁离子结合，如果反应（Taq 或 DNA）需要镁 别进行。即使有些试剂盒能将两个步骤 离子，镁离子就会被释放出来。这种创新技术提高了 cMaster RTplus PCR 的灵敏 合而为一，但是同样因为上述的缓冲液 度和特异性。使 cMaster RTplusPCR 试剂盒既能进行一步法，又能进行两步法 RT 不兼容性，极大地限制了检测灵敏度。 －PCR，而且具有很大的动力学检测范围，能扩增得到的PCR产物长度范围也很 Eppendorf 设计了一个含有全新化学物 大（一步法反应最长可扩增5.3 kb 片段；两步法方案最长能扩增 12.3 kb 片段）。 质的新试剂盒，使一步法 RT－PCR 更 加有效，在两步法实验中可以获得更高 下面的实验可以展示该试剂盒在不同应用中的表现。 的灵敏度。本文将对新试剂盒的表现进 实验 1 关注新试剂盒在一步法 RT－PCR 中卓越的灵敏度。而在一步法应用中， 行检验。 最重要的因素就是能够采用尽可能少的目标材料进行有效工作。 材料和方法 实验 2 显示应用一步法方案进行长距离 RT－PCR 不再是个难题。试剂盒中创 新的缓冲液能同时保证逆转录酶和高保真酶混合物都具有最佳延伸性。 Eppendorf cMaster RTplusPCR 系统 Eppendorf Perfect RNA Eu