第二章 基因工程原理及其在食品科学中的应用.pptVIP

Fall, 2001 Biotech 转基因植物与农作物的抗性 耐储转基因农作物 转基因植物 基因工程疫苗 第一节 基因工程基础第二节 基因工程研究第三节 基因工程在食品科学中  的应用 第一节 基因工程基础 孟德尔遗传因子: 1857-1864 遗传因子的分离 多对遗传因子分离后的自由组合 From：《基因Ⅷ精要》 基因工程的基本定义 基因工程(gene engineering)常和以下名称混用: 基因工程的研究内容 基因工程的发展史 基因工程的意义 二、基因工程的工具酶 （一）限制性内切酶 （restriction endonuclease，RE表示） 限制性内切酶的分类 （二）DNA聚合酶 DNA聚合酶的共同结构 T4-DNA连接酶 来源：T4噬菌体感染的大肠杆菌 底物：双链DNA平末端，粘性末端及单链 缺口 作用：依赖ATP 对热敏感 DNA连接酶特点： 粘性末端DNA片段的连接 平末端DNA片段的连接 催化外源DNA和载体分子连接 ２）富含ＧＣ ３）对称性—双对称 EcoRI 5’-G A A T T C-3’ 3’-C T T A A G-5’ ４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外 ５）限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-Ｐ和３’-ＯＨ 2.??末端种类 １）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸 Pst I 5’-CTGCAG-3’ 5’-CTGCA G-3’ 3’-GACGTC-5’ 3’-G ACGTC-5’ ２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸 EcoRI 5’-GAATTC-3’ 5’-GOH PAATT-3’ 3’-CTTAAG-5’ 3’-CTTAAP HOG-5’ ３）?平头末端 SmaI 5’-CCCGGG-3’ 5’-CCC GGG-3’ 3’-GGGCCC-5’ 3’-GGG CCC-5’ 粘性末端与平头末端 粘性末端：一类是两条DNA链断开的位置是交错对称的，产生的DNA片段末端的一条链多出1至几个核苷酸，同具有互补核苷酸的另一DNA片段末端可以粘结，这样的DNA片段末端称为粘性末端 。 平末端：两条链上断裂的位置处在识别序列的对称结构中心，产生的DNA末端是平齐的，称为平末端。 3.同裂酶与同尾酶 同裂酶：来源不同，识别序列和切割方式均相同。如：Hpa Ⅱ和Msp Ⅰ, CCGG 同尾酶：识别序列不同，但产生相同的粘性末端。 4.限制性内切酶的反应系统 底物DNA 包括 酶反应缓冲液 反应温度 5.限制性内切酶用途 DNA重组 限制酶（物理）图谱绘制 突变分析（RFLP分析） 限制酶的部分酶切与完全酶切 定义：以单链或双链DNA为模板， 合成新的DNA链所需要的酶。 本质：制造DNA的酶 结构：大裂口 三个独立的结构域 “掌心”、“手指”、“拇指” 基因工程中常用的DNA聚合酶有： ①大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ （全酶）； ②大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 大片段（ Klenow ） ③ T4-DNA聚合酶 ④Taq DNA聚合酶 ⑤依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶） ⑥末端转移酶 E.coli 的DNA聚合酶系统 类型： pol I 参与DNA修复, 具3’→5’和5’→3’外切酶活性 pol II 参与DNA修复, 具3’→5’外切酶活性 pol III 参与DNA复制, 具3’→5’和5’→3’外切酶活性 E.coli pol I的特点 1）具两种外切酶活性: 5’→3’外切酶活性 3’→5’外切酶活性 2） 聚合酶活性，5’→3’, 要求带3’-OH引物和模板DNA，其延续性受反应条件的影响 在蛋白酶作用下，