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第九章 聚合酶链反应及相关技术 上海交通大学 樊绮诗 聚合酶链反应于二十世纪80年代由K.Mullis建立，并和定点突变的发明者M.Smith一起荣获1993年度 诺贝尔化学奖，为生命科学领域的研究开创了崭新时代。 第一节 聚合酶链反应 聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）是DNA体外复制反应，基本原理与细胞内DNA的复制相似 一、PCR反应原理和反应过程 1.原理 DNA的体外复制包括3个步骤： 变性（denaturation）: 94?C～95?C 退火（annealing） : 40?C～70?C 延伸（extension） : 72?C 一、PCR反应原理和反应过程 变性: DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链分子作为 反应的模板 退火: 引物与模板互补结合，形成杂交链 延伸: 按照模板链的序列以互补的方式依次把dNTP加至引物的3′端，Taq DNA聚合酶使杂交双链不断延伸，直至形成新的DNA双链 一、PCR反应原理和反应过程 一、PCR反应原理和反应过程 一、PCR反应原理和反应过程 二、PCR的反应体系 1.模板（template） 基因组DNA、RNA、质粒DNA、线粒体DNA等 RNA作为模板时，须先将RNA逆转录为cDNA 模板量：1000ng、500ng、100ng、50ng? 反应体系中较低量的模板有利于提高扩增产量和减少非特异性扩增 2.引物(primer) 化学合成的寡核苷酸 与模板特异地结合 决定产物的特异性和长度 设计引物的原则(一) 两条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负链序列互补 长度为18～25个核苷酸 二条引物之间避免形成引物二聚体 设计引物的原则(二) 引物的碱基组成应平衡，C+G 碱基含量在引物中的比例一般以45%～55%为宜 引物退火温度计算：Tm=2（A+T）+4（C+G） 引物的5′端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标记） 3.脱氧核苷三磷酸（dNTP） dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合物 反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致 浓度过高虽能加快反应速度，但非特异性扩增也随之增加 最适浓度：20～200μmol/L 4.Taq DNA聚合酶 从一种生活在热泉（80℃～90℃）中的水栖噬热菌（Thermus aquaticus, Taq）中提取，有很高的耐热稳定性 Taq 酶的作用: 在模板指导下，以dNTP为原料，在引物3′-OH末端加上脱氧单核苷酸，形成3′, 5′-磷酸二酯键，使DNA链沿5′→ 3′方向延伸，催化DNA合成 最适酶量：1～2.5U 二、PCR的反应体系 Taq DNA聚合酶无3′→ 5′外切酶活性，因而无校正功能，在复制新链的过程中会发生碱基错配 Taq DNA聚合酶在每次循环中产生的移码突变率为1/30000，碱基替换率为1/8000，因此扩增的片段越长，错配的机率越高 二、PCR的反应体系 耐热的高保真 DNA多聚合酶： Pwo DNA polymerase Tth DNA polymerase Pfu DNA polymerase 高热稳定性，高保真性，能降低碱基错配率 5.镁离子浓度 对反应系统本身、稳定核苷酸和提高Taq 酶的活性有直接影响 PCR反应体系中dNTP、引物、模板DNA及鳌合剂均可与Mg2+结合，降低游离Mg2+的浓度，影响酶的活性 dNTP浓度为200μmol/L时，MgCl2浓度为1.5mmol/L较宜 6.其它反应因素 pH：反应所需的最适pH值在7.2左右 盐：合适的盐浓度有利于稳定杂交体，有利于引物与模板杂交 基质：牛血清白蛋白、明胶、Tween20、DTT等 三、PCR的反应条件 1.反应温度 变性温度：94℃～97℃ 退火温度：低于引物Tm 5℃左右 温度过高：降低扩增效率 温度过低：增加非特异性扩增 延伸温度：72℃ 2.反应时间 第一次变性应给予足够时间 每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度，时间过长易导致非特异性扩增 3.循环次数 一般设为25～35个循环 每一个循环使一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长 三、PCR的反应条件 一个分子的模板经过30个循环，理论上即可得230(约109)个拷贝产物 实际反应中，每个循环的扩增效率大多约为85%左右 三、PCR的反应条件 扩增反应的平台效应： PCR反应产物呈指数性增长，但这种增长形式在扩增25～35个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台，此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长。 三、PCR的反应条件 平台出现得迟早与模板的初始量有关