第二十二章 高效液相色谱法.pptVIP

第二十二章 高 效 液 相 色 谱 法 第一节 概述 高效液相色谱法（high performance liquid chromatography, HPLC）是20世纪六十年代末在经典液相柱色谱法的基础上引入了气相色谱的理论和技术，采用高压泵、高效固定相以及高灵敏度检测器发展而成的分离分析方法。 第一节 概述 经典柱色谱法流动相是在常压或低压下运行，传质速度慢，所用固定相颗粒粗，柱效低，分离时间长；色谱柱不能连续使用；样品用量大，灵敏度低；除了用于制备分离外，不 能在线检测。HPLC和GC的基本理论一致，定性定量原理完全一样，均可用计算机控制色谱条件和色谱的处理程序进行在线检测。 第一节 概述 HPLC和GC的不同点为： ①流动相不同：GC用气体做流动相，载气种类少，性质接近，改变载气对柱效和分离效率影响小。HPLC以液体做流动相，且液体种类多，性质差别大，可供选择范围广，是控制柱效和分离效率的重要因素之一； ②固定相差别：GC多是固体吸附剂或在担体表面上涂渍液体固定相，且粒度粗。HPLC大都是新型的固体吸附剂、化学键合相等，粒度小（一般为3～10μm）； ③使用范围更广：GC主要用于挥发性、热稳定性好的物质的分析。因此，GC只能分析占有机物总数15%～20%的物质。HPLC可分析高沸点、难挥发和热不稳定的化合物、离子型化合物和高聚物乃至生物大分子等物质。 第一节 概述 HPLC采用高灵敏度检测器，如紫外检测器的最小检测量可达纳克(10-9g)级、荧光检测器的灵敏度可达10-11g。HPLC的特点：分离效率高、分析速度快、灵敏度高、色谱柱可反复使用、流动相可选择范围宽、流出组分容易收集、操作自动化、适用范围广。 第二节 高效液相色谱仪 高效液相色谱技术得到迅速发展，基本原理和色谱流程都是相同的，仍然由流动相输送系统、进样系统、色谱分离系统、检测记录数据处理系统组成。 溶剂贮器1中的流动相经混合室2混匀，被泵3吸入，然后输出，导入进样器5。被分析样品用注射器6由进样器处注入，并随流动相一起依次通过预柱7、色谱柱8后进入检测器9。检测信号经过数据系统10处理，记录色谱峰面积和色谱图。若是制备色谱，可以使用馏分收集器11。复杂样品采用梯度洗脱（借助于梯度控制器4）使样品各组分均得到最佳分离。整个仪器可由微处理机操纵，包括数据处理和操作控制。 液相色谱仪（2） 第二节 高效液相色谱仪 一、输液系统 （一）流动相贮器 流动相贮器俗称贮液瓶，它对大多数有机化合物呈化学惰性，耐酸碱腐蚀。常见质地为玻璃或塑料，容量约为0.5L～2.0L，通常无色透明，若流动相需避光，有棕色瓶供选择。贮液瓶放置位置要高于泵体，以便保持一定的输液静压差。使用过程贮液瓶应密闭，以防溶剂蒸发引起流动相组成的改变和防止空气中的O2、CO2重新溶解于已脱气的流动相中。 第二节 高效液相色谱仪 （二）脱气装置 流动相在使用前必须进行脱气处理，目的是除去其中溶解的气体。在装入贮液瓶之前必须经过0.45μm滤膜过滤。为了使溶剂便于脱气，贮液瓶常需贮备抽真空及吹入惰性气体装置。在洗脱过程中如存在气泡会增加基线噪音，严重时使分析灵敏度降低。此外溶解在流动相中的氧气，会造成荧光猝灭，影响荧光检测器的检测，还可能导致样品中某些组分被氧化或使柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。常用的脱气方法有如下几种： 第二节 高效液相色谱仪 1．超声波振动脱气 使用超声波提取器的方法，将欲脱气的流动相置放于超声波提取器中，用超声波振荡10～30min。此法较简单、常用。 2．抽真空脱气 用微型真空泵，降压至0.05～0.07Mpa既可除去溶解的气体，使用水泵连接抽滤瓶和G4微孔玻璃漏斗可以一起完成过滤机械杂质和脱气的双重任务。由于抽真空会引起混合溶剂组成的变化，故此法适用于单一溶剂的体系脱气。对于多元溶剂体系，每种溶剂应预先脱气后再进行混合，以保证混合后的比例不变。 第二节 高效液相色谱仪 3.加热回流脱气 用于需要彻底脱气的流动相（电化学检测器），因为使用了回流冷凝器可减少挥发性组分的损失。此法的脱气效果较好，不提倡用于混合流动相。 4.吹氦脱气 使用在液体中比空气溶解度低的氦气在0.1Mpa压力下，以60mL/min的流速缓缓地通过流动相10～15min，赶去溶入的气体。此法适用于所有的溶剂，脱气效果较好，但价格较贵。 5．真空在线脱气 把真空脱气装置串接到贮液系统中，并结合膜过滤器，实现流动相在进入输液泵前的连续真空脱气。此法可适用于多元溶剂体系，其结构示意图见图22-2。 第二节 高效液相色谱仪 （三）输液泵 输液泵的种类很多，目前，多用柱塞往复泵。柱塞往复泵(图22-3)工作时柱塞向前运动