第六章 蛋白印记（Western blotting）.pptVIP

一、实验目的 熟悉免疫印迹的原理和用途，学习免疫印记的操作技术和结果判定方法。 二、原理 印迹法：将生物大分子物质通过不同的途径转移到固相载体上，转移后的固相载体经淬灭试剂处理后，用适当的溶液漂洗，置于含底物或探针的溶液中孵育，可与对于的探针反应，显出特异条带。 三、材料 1.待检抗原：APP分泌性蛋白和菌体蛋白  2.SDS凝胶 3.1×Tris-Gly电泳缓冲液  4.预染蛋白质Marker 5.考马斯蓝染色液 * * 第六章 蛋白印记 （Western blotting） 二、原理 常见的印记法有Southern、Northern、Western印迹法，分别用于检测DNA、RNA和蛋白质。 其中Western印记又称为免疫印迹。 二、原理 其中，免疫印迹的基本原理是将凝胶电泳与固相免疫相结合，其主要的操作分为三个过程： 二、原理 1）电泳：SDS分离各蛋白组分； 2）印记：将蛋白质从凝胶转移到固相载体； 3）免疫检测：依次与一级抗体和标记的二抗体反应，通过底物或激发光激发显色，观察目的条带的有无。 二、原理 制备gel 处理Sample Loading sample SDS将gel移入staining solution destaining solution 直到染色对比清晰为止 Data判读 Gel转印硝酸纤维素膜 Western blotting HRP detection Data判读 实验流程: Separating gel 12 % Acrylamide (Tris-HCl, pH8.8) Stacking gel 5% Acrylamide ( Tris-HCl, pH6.8) Running buffer : Tris-HCl, glycine, pH 8.3 Discontinuous Gel Electrophoresis 二、原理 透明 黑色 NC膜 塑料夹板 海绵垫 定性滤纸 转印 抗体 HRP-二抗 转印滤膜 显色 免疫染色流程及结果 转印三明治 转印及免疫染色流程： 二、原理 二、原理 优点：SDS的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性。 用途：常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。 二、原理 不足：操作要求高 成本高 结果判断主要依据条带的有无以及条带的亮度 二、原理 本次实验以APP分泌性蛋白和菌体蛋白为检测抗原，通过免疫印迹方法初步了解免疫血清中针对APP的抗体种类及含量。 三、材料6.考马斯蓝脱色液7.转印缓冲液8.硝酸纤维素滤膜9.定性滤纸10.1×TBST洗涤液 三、材料11.封闭液：5%脱脂牛奶12.一级抗体：兔抗APP免疫血清13.二级抗体：HRP标记羊抗兔IgG14.显色剂：3,3’-二氨基联苯胺（DAB）（A+B，使用前混合）15.终止液：蒸馏水 四、操作步骤1.SDS凝胶制备及蛋白质样品的处理：略。 四、操作步骤2.电泳分离： 在第1至12孔中分别加入：菌体－分泌蛋白-Marker-空白-Marker-分泌蛋白-菌体-空白-空白-Marker-分泌蛋白-菌体。 四、操作步骤2.电泳分离： 将电泳装置与电源相接，80V，30min；换120V，待溴酚蓝刚移出分离胶底部时关掉电源（约90min）。 四、操作步骤3.转印： 电泳结束后，将凝胶转移至洁净塑料薄膜表面，用钢尺切取1～7孔，剔除浓缩胶，量取实际转膜用胶块大小（长×宽）。剩余凝胶用染色液浸泡。 四、操作步骤3.转印： 戴上手套，切4张定性滤纸和1张NC膜。用蒸馏水润湿定性滤纸和NC膜，用铅笔在滤膜一角做标记（组号）。 滤纸和NC膜的大小与凝胶相同或略小 四、操作步骤3.转印： 安装转印装置：夹板（黑色）-海绵垫-2层滤纸-凝胶-NC膜-2层滤纸-海绵垫-夹板（白色），固定，通电，调80V，转印1小时。 每加一层都需准确对齐，并排尽气泡。 四、操作步骤4.封闭 转印结束后，取出NC膜放入洁净平皿，加入封闭液20mL，平放于摇床上室温反应1小时。 四、操作步骤5.洗涤 用眼科镊夹住硝酸纤维素滤膜某角，放入另一洁净平皿，加入洗涤液15mL，置摇床上5min，换新的洗涤液；共洗涤3次。 四、操作步骤6.加一抗 把NC膜放入一新的平皿中，加入用TBST以1:40稀释的免疫血清15mL，平放于摇床上室温反应30min。之后洗涤滤膜3次。 四、操作步骤7.加二抗 把NC膜放入一新的平皿中，加入用TBST以1:5000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG 10ml，室温反应30min。 之后，NC膜用TBST洗涤3次，再