甜菜抗丛根病胞内钙信号特征研究.pdfVIP

摘 要 甜菜是世界上重要的糖料作物，是除热带甘蔗以外的一个主要食糖来源。在 甜菜生产过程中受到诸多病害的危害，其中甜菜丛根病是最为严重的病害之一。 甜菜丛根病是近年来在世界各地普遍发生的一种甜菜病毒病害，该病对甜菜生产 危害极大，发生后块根减产 40%～60%，含糖下降4～9 度，严重地块甚至绝产， 已成为制约甜菜生产及制糖工业产业发展的重要因素。提高甜菜抗丛根病性已成 为甜菜生产需迫切解决的问题。因此，深入研究甜菜抗丛根病生理机制，对加速 甜菜抗病育种、扩大甜菜种植面积、提高农民收益具有重大意义。本论文采用钙 离子荧光探针、激光共聚焦显微镜技术及同位素标记技术，以侵染丛根病病源甜 菜叶片为研究材料，通过研究病源侵染后信号转导途径中第二信使—胞内钙离子 浓度与分布及依赖于钙离子的蛋白激酶活性变化，揭示胞内钙离子及蛋白激酶在 甜菜抗丛根病信号转导途径中的作用，为丰富和完善甜菜抗丛根病细胞信号转导 机理提供科学依据和理论基础。研究主要取得如下结果： 1．建立了检测甜菜细胞内钙离子的技术体系。应用钙离子荧光探针结合激 o 光共聚焦显微镜技术，以甜菜叶片为材料，低温 4 C 下装载钙离子荧光探针 -1 o Fluo-3/AM （20 μmol·L ）120min，将材料置于室温 25 C 放置 120min，将钙 离子探针 Fluo-3/AM 置入甜菜叶片细胞内，且在实验过程中未发现有荧光猝灭现 2+ 象。为研究甜菜坏死黄脉病毒侵入甜菜叶片细胞后胞内 Ca 变化提供技术支撑。 2+ 2.甜菜坏死黄脉病毒浸染甜菜叶片后，抗丛根病品种胞质 Ca 浓度发生相应 2+ 2+ 的变化，并得到胞质 Ca 快速增高的特征曲线，而感病品种胞质 Ca 浓度基本未 2+ 发生变化。病毒侵染甜菜叶片引起的胞内 Ca 水平增高主要来源于细胞间隙的钙 2+ 离子。表明 Ca 作为甜菜-丛根病病原物互作过程中的第二信使是激活甜菜抗丛 根病所必经途径。 3.茉莉酸、水杨酸作为信号分子在植物抗病信号转导途径中 占据重要的位 置，外源 JA、SA 处理可以诱导甜菜叶细胞游离钙离子浓度升高，与甜菜坏死黄 脉病毒侵染甜菜叶片细胞胞内钙离子的变化相一致，初步表明 JA、SA 是病毒侵 染甜菜后胞内钙信号的上游信号分子。 4.从外源底物、ATP 浓度、反应时间、金属离子浓度等方面筛选测定甜菜叶 片细胞内蛋白激酶活性的最佳条件，建立了体外检测甜菜叶片胞内蛋白激酶活性 的体系：外源底物为 Histon-Ⅲ，其浓度为 0.5mg/mL， ATP 浓度为 50 μmol/L， 2+ 2+ 2+ 2+ Mg 浓度为 5mmol/L，启动反应 10min。通过在体系中不加 Ca 、加 Ca 、加 Ca 2+ 和 CaM、加 Ca 和 TFP 进行蛋白激酶活性对比试验，初步鉴定出受甜菜坏死黄脉 病毒侵染甜菜叶片后钙信号响应的蛋白激酶为 CDPKs。 关键词：甜菜；丛根病；细胞信号转导；胞内钙离子；蛋白激酶 Research on Characterstics of Intrcellular Calcium Signal during the Process of Sugar beet (Beta Vulgaris L.)Resisitance to Rhizomania