隐孢子虫Gal／GalNAc特异性凝集素p30原核表达系统的构建及鉴定.pdfVIP

134 中 国 人 兽 共 患 病 学 报 ChineseJournalofZoonoses 2O10，26 (2) 文章编号 ：1002—2694f2010)02—0134—06 隐孢子虫Gal／GalNAc特异性凝集素p30 原核表达系统的构建及鉴定* 黄慧聪 ，赵巧莲 ，谭 峰，潘长旺 摘 要：目的 获取 隐孢子虫Gal／GalNAc特异性凝集素p30基 因，并构建原核表达系统 ，获得相应 的重组蛋 白。方法 采用聚合酶链反应(PCR)技术 ，从微小隐孢子虫基 因组 中扩增 出p30基 因，然后将其克隆入 pMD18-T载体 ，转化后挑取阳性 克 隆进行酶切和测序鉴定 ，并进行生物信息学分析及预测。再将亚克隆与表达载体 PET一28a(+)分别酶切并连接 ，经 IPTG 诱导表达 ，表达产物用 Ni—NTA亲和层析法纯化，SDS—PAGE和 Westernblotting检测表达效果 。结果 PCR扩增得到特异 的微小隐孢子虫Gal／GalNAc特异性凝集素p30基 因，测得的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与GenBank上提交的序列 同 源性分别为 98 ～100 和 99 ～100 ，理论等 电点和分子量分别为6．4854和31842Da，并存在 9个潜在 的抗原表位 。经 酶切 、测序结果表明质粒 已导入 Rosetta。SDS—PAGE和 Westernblotting证实重组菌成功表达融合蛋 白。结论 成功构建微 小隐孢子虫Gal／GalNAc特异性凝集素 p30原核表达系统。 关键词 ：隐孢子虫；p30基 因；克隆；原核表达 中图分类号 ：R382 文献标识码 ：A Constructionand identificationofprokaryoticexpression system for galactose／N--acetylgalactosamine--specifriclectinp30genefrom Cryptosporidium HUANG Hui—cong，ZHAO Qiao—lian，TAN Feng，PAN Chang—wang (DepartmentofParasitology，WenzhouMedicalCollege，Wenzhou325035，China) ABSTRACT：Tocloneandconstructaprokaryoticexpressionsystem containingthegalactose／N—acetylgalactosamine-spe— cificlectinp30geneofCryptosporidium ，thep30genewasamplifiedfrom genomicDNA ofCryptosporidiumparvum byPCR andclonedintovectorpMD18一T directly．ThepositivecloneswereidentifiedbyEcoR I，XhoIdigestionandsequenced．The genestructureanditspossiblefunctionwereanalyzedandpredictedbyusingrelatedbioinformaticssoftwares．TheP30gene wasrecombinedwithplamidpET一28a (+ )toconstructtheprokaryoticexpressionvectorandwasexpressedinE．coliwith IPTG induction．Ni—NTA affinitychromatographywasusedtoextractP30proteinandtheexpressioneffectandpurificationof P30proteinweredeterminedbySDSandWesternblotting．Itwasdemonstratedthatthegalactose／N—acetylgalac— tosamine-specifi