垂直板电泳分离蛋白质--教学课件.pptVIP

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质 韩文军 周晓慧 生物技术教研室 一、实验目的 了解电泳实验原理 掌握电泳实验操作规程 学习用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理与技术 二、电泳的基本原理 电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。 三、电泳的分类 从原理上：区带电泳，移界电泳，等速电泳，等电聚焦（IEF），双向电泳等。 凝胶系统的均匀性：连续性凝胶电泳，不连续凝胶电泳 按外形：圆盘状电泳，水平板电泳，垂直板电泳及毛细管电泳等。 被分离的物质是否变性：非变性、变性（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ） 从载体上：自由流电泳，凝胶电泳，琼脂糖电泳，纸电泳等。 四、电泳中的一些基本概念 1.凝胶浓度（T） 2.交联度（C） 3.分离胶 4.浓缩胶 5.迁移率 6.指示剂 7.聚合 8.固定 9.染色 10.脱色 五、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 1. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的特点 （1）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的支持介质是聚丙烯酰胺凝胶。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(CH2=CHCONH2简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(CH2(NHCOHC=CH2) 2简称Bis)在加速剂N，N，N?，N?—四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵 (简称AP)或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶（其网孔大小可由凝胶浓度和交联度加以调节） ，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。常用于蛋白质的定性分析，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。 （2）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统，即只有分离胶的连续系统和有浓缩胶与分离胶的不连续系统。 （3）强还原剂可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键， SDS与蛋白质充分定量结合（平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子），以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构，消除了各种蛋白质本身电荷上的差异，从而使蛋白质电泳的速度只与蛋白质的分子量相关，而与蛋白质本身所带电荷无关。 （4）由于具有浓缩效应、分子筛效应和电荷效应，使被分离物质在电泳时产生不同的泳动速率而相互分离。 图4 电泳过程示意图A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。 C显示蛋白质样品分离成数个区带。 （5）利用特异性的颜色反应使蛋白质着色，这样就可在凝胶中展现出蛋白质条带。 2、仪器设备及试剂 （1）仪器设备： 恒流恒压电泳仪及配套电泳槽 冷冻离心机及离心管 制冰机 pH计 真空机 取样器 进样器 (2).试剂 30%凝胶贮液 29.2g 丙烯酰胺，0.8g 甲叉双丙烯酰胺加双蒸水溶解后定容到100ml，过滤后贮存到棕色瓶。 浓缩胶buffer（0.5M Tris-HCl,pH6.8) 6.06g Tris,0.4g SDS, 加双蒸水80ml溶解,用HCl调pH为6.8后定容到100ml，过滤后贮存 分离胶buffer(1.5M Tris-HCl buffer， pH 8.8 ) 18.17g Tris,0.4g SDS,加双蒸水80ml溶解，用HCl调pH为8.8后定容到100ml，过滤后贮存 Tris-甘氨酸电泳缓冲液（pH 8.3) 30g Tris,10g SDS, 144g甘氨酸，加双蒸水800ml溶解后定容到1000ml 固定液 甲醇200ml，乙酸50ml，加水定容到500ml. 考马斯亮蓝染色液 42ml水，58ml磷酸加50g硫酸胺溶解后再加0.6g G-250溶解，加水定容到400ml，再加入100ml甲醇 AP% 100mg过硫酸胺溶于1ml水 上样缓冲液 1g SDS，5ml Glycerol,0.5mg Bromophenol blue,2.5ml 巯基乙醇,10ml 浓缩胶 buffer,dd H2O to 50ml. 0.1%溴酚蓝水溶液 （1）? 11.5%分离胶配制(20ml) 凝胶贮液 7.7ml 分离胶buffer 5ml H2O 7.25ml 10%AP 54ul TEMED 9u