粪便中小肠结肠炎耶尔森菌PCR检测方法的建立.pdfVIP

2010年2月第7卷第5期 ·实验研究 · 粪便中小肠结肠炎耶尔森茵 PCR检测方法的建立 段 丽莉 (吉林省吉林市疾病预防控制 中心微生物科 ，吉林吉林 132001) [摘要】小肠结肠炎耶尔森菌是一种人畜共患的病原菌 。它在 自然界 中广泛分布 ，包括人、猪 、牛等哺乳动物 ，禽类的 排泄物 ，蜗牛等冷血动物，昆虫 ，未处理 的冷水 ，污水 ，肉，乳制品，蛋制品，水产品和冰激凌 。所致疾病主要有 胃肠炎 型和肠道外型。我科应用 PCR方法检测小肠结肠炎耶尔森菌 ，及时发现患者和带菌者 ，为流行病学提供实验室依 据 ，及时控制传染源 ，为预防疾病起重要作用 。 关『键词 J、肠结肠 炎耶尔森茵；PCR检测方法；病原 茵 [中图分类号】R37 文【献标识码】A [文章编号】1673—7210(2010)02(b)一023—03 小肠结肠炎耶尔森菌所致疾病在世界上广泛分布 ．但多 层均变为黄色 (A，A)、不产 H2S、不产气 的菌株进一步鉴定 。 集中在寒冷地区，在我 国东北地区小肠结肠炎耶尔森菌各血 尿素酶试验和动力观察 ：将改 良克 氏双糖上 的可疑培养 清型的分布亦较广泛。本菌可感染人类 以及多种动物 ，包括 物接种到尿素培养基上 ，注意接种量要大 ，挑取一接种环，振 家畜、兽类 、禽类 、鸟类和昆虫 ，并通过排泄物和污染的水 、食 摇数分钟 ，25℃培养 2～4h。然后将 阳性者接种 2管半固体 ， 品传播。 分别置于 25℃和37℃温箱培养 24h，在 25℃有动力者 ，进行 1实验方法 镜检和进一步生化试验。 1．1试 剂 系统生化鉴定 ：可挑取上述可疑的菌落直接用 API20E 干燥培养基 (北京陆桥生物技术有限公司)；生物梅里埃 生化条进行系统生化鉴定 ，确定菌株种属。见表 1。 API20E生化条 ；诊断血清。 1．2仪 器 表 1菌株种属生化鉴别 美 国BIO—PCR仪 ；Thermo生物安全柜 ；离心机。 项 目 小肠结肠炎 中间型耶 弗氏耶 克氏耶 假结核耶 鼠疫耶 1．3样 品采集 耶尔森菌 尔森菌 尔森菌 尔森菌 尔森菌 尔森菌 采集急性期 、用药前采集患者新鲜粪便标本 8例 ，每份 2～5g，放人 Cary—Blair半固体保存培养基 中，4℃冷藏运送至 实验室。 1．4操 作 1．4．1增菌 取 1g粪便接种于 l0ml改 良PBS培养基上 ，置 于4℃ 冷增菌 10～20d。在冷增 菌的第 7、14、21天划线接种于耶尔 森选择性平板 、麦康凯平板 ，25℃培养 24h。增菌管内液体量 较大，在接种前应轻轻混匀 ，再用接种环挑取液体 ，接种于预 先准备好的上述平板 ，采取分区划线的方式 ，一般划 3～4区， 血清学鉴定 ：使用致病性菌株 常见血清型 (我 国一般为 目的是划出单个菌落 。由于总体菌量一般不大 ，每区划完后 0：3、0：8、0：9型)的特异性单克隆抗体进行玻片凝集 ，从而进 可不必烧灼接种环 ．直接划下一区即可。 行进一步鉴定和血清分型 。 1．4．2培养 PCR鉴定 ：毒力基 因扩增 ，主要进行 以下 5个基因的 直接取粪便标本接种选择性平板 (耶尔森选择性平板 、麦 PCR检测。 康凯平板)，25℃培养24h。 A．染色体源毒力基因 1．4．3鉴定 A1ail：是黏附