葱蝇非滞育蛹的全长cDNA文库构建.pdfVIP

2010年 1月 重庆师范大学学报(自然科学版) Jan．2010 第27卷 第1期 JournalofChongqingNormalUniversity(NaturalScience) Vo1．27 No．1 DOI：10．3969／J，ISSN．1672—6693．2010．01．0o5 葱蝇非滞育蛹的全长 cDNA文库构建 黎7YJl~，陈 斌 ，冯国忠，李廷景 (重庆师范大学 昆虫与分子生物学研究所 重庆高校生物活性物质工程研究中心 重庆高校动物生物学重点实验室，重庆400047) 摘要：葱蝇具有兼性滞育的特性且与果蝇近缘，是 昆虫滞育分子机理和冬滞育和夏滞育专化基因比较研究的理想模 式种，本研究 目的在于构建葱蝇非滞育蛹的全长cDNA文库，为进一步的滞育专化基因筛选、克隆和表达分析奠定基 础。利用RNAiso试剂提取葱蝇非滞育蛹的总RNA，采用 SMART技术合成全长cDNA，将限制性 内切酶 sfiI消化后 的cDNA克隆到质粒载体 pDNR—LIB，转化入大肠杆菌(DH10B)，获得原始文库。经过涂平板测定表明，原始文库的 库容量为2．3×10个单克隆；随机挑取 15个单克隆，通过 PCR快速鉴定，插入片段大小在0．4～1．2kb之间，平均 大小在0．9kb，重组率达 100％。这些结果表明本研究所构建文库的代表性和重组片段的序列完整性达到了用于 目 的基因的分离筛选和克隆表达的建库要求。 关键词：葱蝇；非滞育蛹；全长 cDNA文库；SMART技术 中图分类号：Q966 文献标识码 ：A 文章编号：1672—6693(2010)0l一0021—05 滞育(Diapause)是存在于昆虫 中一种普遍的生 本手段之一。cDNA文库便于克隆和大量表达 ，直 理现象，是昆虫长期适应不 良自然环境而获得的一 接筛选到所需的目的基因，并用于该 目的基因的表 种生存本领 。昆虫进入滞育，是 昆虫从环境 中接受 达。另外，全长 cDNA文库构建有助于鉴定基因组 信号刺激到体内激素调节直至滞育调节的一系列的 序列中外显子和内含子的边界，分析基因编码区以 复杂生理过程 ，在 自然情况下滞育的解除要求一定 及基因转录和翻译的水平。利用 cDNA文库可对昆 的时间和一定的条件。昆虫的滞育主要受光周期和 虫进行 比较基因组学的研究，也可研究昆虫体 内重 温度的影响 ¨』。短 日照和低温诱导 昆虫进入冬滞 要代谢酶的组成，例如 Chen等 和 Yoshiga等_9的 育，长 日照和高温诱导 昆虫进入夏滞育。滞育可 以 研究。而对于葱蝇滞育基因的研究，目前相关报道 发生在昆虫生命过程中的任何一个阶段，根据滞育 不多。因此，本研究尝试应用 SMART技术，构建了 所发生的虫态，可将其分为 4种类型：卵滞育、幼虫 葱蝇非滞育蛹的全长 cDNA文库，为葱蝇滞育基因 滞育、蛹滞育和成虫滞育 。 的克隆以及功能的研究奠定了基础。 葱蝇(Deliaantiqua)是分布在北半球一种严重 l材料与方法 的地下害虫，主要危害百合科蔬菜，它广泛分布于亚 洲、欧洲等地。葱蝇属蛹滞育，具有冬滞育和夏滞育 1．1材料及试剂 的特性。目前利用人工饲料该害虫已经在实验室大 葱蝇由本实验室饲养。成虫饲养条件为：温度 量饲养而且蛹能够长期储存 。在系统发育上，葱 (23±1)℃，相对湿度50％～70％，全天光照处理时 蝇与黑腹果蝇 (Drosophilamelanogaster)近缘 。 间与黑暗处理时问