重组大肠杆菌NADP特异性谷氨酸脱氢酶体外分子交联初步研究.pdfVIP

摘 要 蛋白质交联是生物体内普遍存在的一种分子Iai交联形式，与许多生理及病理 过程密切相关。蛋白质如何由单体 (有功能的形式)转变为交联的二聚体或多聚 体的分子机理还不完全清楚。一种假说认为蛋白质分子间交联可以通过以下三步 实现:1)蛋白质构象包括二级结构改变;2)形成分子间二硫键:3)分子间其 他共价键 (异肤键)的形成。本文为了证实或完善和补充蛋白质分子交联的三步 假说，以原核生物的蛋白NADP特异性谷氨酸脱氢酶 (NADP-GDH)和鸡溶菌 酶作为实验材料，采用PCR方法从大肠杆菌DHsa菌株中克隆得到NADP特异性 谷氨酸脱氢酶基因，构建重组表达质粒并在大肠杆菌中高效表达重组 NADP-GDH，应用(HiS)6亲和标签和固定化金属亲和层析技术纯化出重组 NADP-GDH，在体外进行热诱导去折叠和氧化重折叠实验。结果发现:纯化的 野生型重组NADP-GDH经热变性，SDS结果显示出现了二聚体和多聚体 条带;而在相同条件下，当反应体系或上样缓冲液中加入还原剂二硫苏糖醇后没 有二聚体或多聚体的形成。实验结果显示，野生型NADP-GDH有很强的形成异 肤键交联二聚体的倾向，而在同样条件下，半胧氨酸残基定点突变后的 NADP-GDH重组蛋白无法形成分子间二硫键，实验证实经过热诱导去折叠后也 没有出现分子间其他共价键 (异肤键)交联形式。 关键词:蛋白质二硫键异构酶，异肤键，蛋白质分子间交联，热变性，DNA定 点突变，谷氨酸脱氢酶。 Abstract Proteininterchaincross-linkingisacommonphenomenoninthelivingcreatures andarecloselyrelatedwithmanyphysiologyandpathologicprocesses.However themolecularmechanismsofproteinsfrommonomeric/functionalformsinto cross-linkeddimmer/oligomerformsarenotwellunderstood.Experimentswith lysozyme,ribonucleaseAandproteindisulfideisomeraseinvitroshowprotein cross-linkingcanbeaccomplishedinthreeconcertedsteps:(1)achangein proteinconformation;(2)formationofinterchaindisulfidebonds;and口) formation ofinterchain isopeptidecross-links.Forfurtherexploring if cross-linkingcanhappeninheterogeneouspeptides,theinvestigationisextended withE.coliNADP-specificglutamatedehydrogenase(NADP-GDH).NADP-GDH genewasclonedbyPCRfromE.coliDHsa,andinsertedintoplasmidpTrcHisC foroverexpressioninE.coll.ThenitwaspurifiedbyImmobilizedMetalAffiniyt Chromatographywiththehelpof(His)6tag.AtlastNADP-GDHandlysozyme wasmixed during thermalunfolding.The observation revealed that heterodimer/oligomerformationwasascommonashomodimerloligomer formationinthemidpointtemperatureofthermaldenaturation.Howeverno cross-linkeddimmer/oligomerappearedinlowtemperature.Ifthethermal unfoldingsolution contained thereducingagentp-Mercaptoethanol,no cross-linkingwasdetected.Itwasapparentthat