酪蛋白%2f巨细胞病毒(CMV)复合启动%2f增强子指导人乳铁蛋白cDNA表达研究.pdf

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酪蛋白/巨细胞病毒(CⅢ)复合启动/增强子指导 人乳铁蛋白cDNA表达的研究 摘要 转基因动物乳腺生物反应器为获得高质量、低成本的药用重组人乳铁蛋白提 供可能。但是,入乳铁蛋自在转基因动物乳腺中仍多处于较低水平表达.为此, 本研究构建了一对乳腺特异性表达载体,制备了转基因小鼠,通过比较两种不同 构件(即是否含有CMV增强子部分),探讨添加CMV增强子对于提高人乳铁蛋 白乳腺特异性表达水平的作用;并且摸索在个体水平筛选转基因高表达个体的方 法。 本研究之构建选用牛asl-酪蛋白的调控序列,包括长2264bp5’端调控区,即 bp到.6264 sl一酪蛋 质粒(实验室保存)获得hLFeDNA片段(约2.3kb),共同构建了由牛a 白5’端+bLF 牛as1.酪蛋白5’端+增强子片段+hLF 白eDNA乳腺特异表达载体AP。 法将表达载体片段导入小鼠受精卵雄原核,注射后存活卵数(移植数)630枚,移 植受体数37只,受体怀孕数13只,获得出生仔鼠51只,受精卵存活率为42.3%; j AF构件的质粒用上述同样方法处理后,制备转基因小鼠,获得受精卵851枚,通 过原核显微注射法将表达载体片段导入小鼠受精卵雄原核,注射后存活卵数(移 卵存活率为57.6%。 转基因整合率为3.9%。转基因原代小鼠与正常小鼠交配,获得Fl代整合小鼠5 只,F2代整合小鼠7只,建立人乳铁蛋白转基因小鼠品系。 采用酶联免疫法(ELISA Blot)对AP原代转基 assay)和蛋白印迹(Western 因小鼠及其后代的乳汁表达水平进行检测。ELISA检测结果表明:在AP转基因原 代小鼠和Fl、F2代乳汁中人乳铁蛋白表达均呈阳性,其中原代表达量约在 Blot结果表明:转基因小鼠乳清检测有与标准人乳铁蛋白带相 3--69·L.I。Western 一致的条带。此外,转基因小鼠血液、泪液的ELISA检测结果显示,所构建的表 达载体具有乳腺特异性。对AF转基因小鼠乳汁收集,送至江苏省原予医学研究所 检测,检测结果实验室保存。 通过近交筛选,获得AP转基因纯合子小鼠(辛38’、d3矿),催乳获得小鼠乳 汁,ELISA检测乳汁中入乳铁蛋白有较高表达量。同时利用本实验室已获得的 双重杂合子小鼠。 比较AF与AP,后者在前者的基础上增加了CMV增强子;在转基因小鼠个 体表达水平上,后者明显高予前者。此试验结果证实了我们的设想,即牛的Qsl一 酪蛋白调控序列与CMV增强子复合启动子构建乳腺特异性表达载体,能够大大提 高人乳铁蛋自eDNA的表达。本实验还表明,我们所构建的人乳铁蛋白乳腺特异 性表达载体具有很好的乳腺组织表达特异性。同时,转基因小鼠纯合子的筛选, 也为我们缩短制备转基因大动物的周期提供理论依据。 s1.酪蛋白、人乳铁蛋白、转基因小鼠 关键词:CMV、乳腺生物反应器、牛a Studieson ofhuman-lactoferrincDNAunder expression gene the of asl bovinecasein/CMV multiplepromoter/enhancer Abstract scientiststo devoted bioreactorofhumanlaetoferrin Many mammarygland study by alIin

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