SMS2基因敲除小鼠海马神经细胞自噬现象研究.pdfVIP

摘 要 自噬是存在于真核细胞中普遍的生命现象，是近十年来生命科学领域一个新的研究 热点，在降解胞内蛋白、蛋白质结构重建、清除废物、保持细胞内环境稳定等方面发挥 着非常重要的作用。自噬对于降解错误折叠和聚集蛋白方面起着关键的作用，与神经变 性疾病关系密切，受到越来越多研究者的关注。本课题以SMS2 基因敲除（SMS2-/- ）小 鼠为研究对象，应用MAPLC3 和Beclin-1 免疫细胞化学，PCR、电镜和Western blotting 等技术方法，以期探讨SMS2 基因敲除小鼠海马神经细胞内一种重要的调节细胞凋亡的 第二信使-神经酰胺增多后，对于神经细胞自噬现象的影响，为通过诱导自噬治疗神经 变性疾病提供临床治疗依据。 为了研究SMS2基因敲除小鼠海马神经细胞内神经酰胺增多后，对于神经细胞自噬 现象的影响，本实验室从美国纽约州立大学动物实验中心引进的SMS2基因敲除小鼠的 杂合子 SMS2+/-小鼠为种鼠，利用PCR 方法鉴定培育出的 SMS2-/-小鼠为模型，探讨神 经酰胺对神经细胞自噬的影响，从而为神经变性疾病的临床治疗和和预防提供理论依 据。 目的：利用SMS2基因敲除小鼠探讨神经酰胺对海马神经细胞自噬现象的影响，从 而为神经变性疾病的临床治疗和和预防提供理论依据。 方法：利用从美国纽约州立大学动物实验中心引进的 SMS2+/-小鼠（雄性一只，雌 性两只，背景为C57BL/6J 小鼠）为种鼠，将杂合子SMS2+/-小鼠采用杂交、回交、互交 的方法进行繁殖，用酚氯仿提取法提取小鼠基因组DNA ， PCR 扩增目的基因，琼脂糖 凝胶电泳对小鼠基因型做出鉴定，获得雄性和雌性纯合子 SMS2-/-小鼠，按照同样方法 进行繁殖；以SMS2-/-小鼠为研究对象，野生型（WT ）小鼠为对照组，利用透射电子显 微镜观察P14 和P30 模型组与对照组海马神经细胞中自噬和自噬溶酶体结构；利用免疫 荧光染色技术观察P7 、P14 和P30 模型组和对照组神经细胞自噬细胞数，并观察Beclin-1 与 MAPLC3 免疫细胞化学染色在神经细胞的共表达情况；利用Western blotting 方法检 测P14 和P30 模型组与对照组小鼠海马CA1 区神经细胞MAPLC3 的蛋白水平；采用单 因素方差分析LSD 检验对数据进行分析。 I I 结果: 1. SMS2-/-小鼠海马CA1 区神经细胞自噬现象: ① 电子显微镜下，SMS2-/- 小鼠较 WT 小鼠海马神经细胞内出现较多自噬体或自噬溶酶体样结构；②光镜下， SMS2-/-小鼠P7 、P14 和 P30 CA1 区神经细胞自噬细胞数较WT 小鼠高，变化有显著差 异（P ﹤0.01）。2. Beclin-1 对于自噬的调节作用: ①Beclin-1 在SMS2-/-小鼠与WT 小 鼠的表达情况比较与MAPLC3 基本一致，P7 、P14 和P30 SMS2-/-小鼠Beclin-1 阳性细 胞数明显多于对照组（P0.0 1）。②Beclin-1 与 MAPLC3 二者在同一细胞中基本呈重 叠表达3. 利用Western blotting 检测P14 和 P30 SMS2-/-小鼠和WT 小鼠海马CA1 区神 经细胞 MAPLC3 蛋白的相对表达量，SMS2-/-小鼠较 WT 小鼠高，变化有显著差异（P ﹤0.01 ）。 结论：SMS2-/-小鼠海马神经细胞内神经酰胺增多，神经酰胺不仅促进细胞的凋亡， 同时促进自噬，造成小鼠海马神经细胞自噬现象增强。 关键词: SMS2 ，自噬，海马神经细胞，神经酰胺 II ABSTRACT Autophagy is a universal life phenomenon that exist in eukaryotic cells , of the last ten years, this is a focus in life sciences that is important process for cellular maint