多光子荧光显微镜介绍.pdfVIP

OLYMPUS 北京 2007-5 多光子荧光显微镜介绍 双光子激发显微镜（Two-photon excitation microscopy ）又称作非线性、多光子、 双光子激光扫描显微镜，是建立在先进的激光扫描显微镜技术基础上的实验方法，是激光扫 描共聚焦显微镜和反卷积显微镜的理想替代产品，在三维观察上提供了更优秀的光学切片能 力。多光子荧光激发方法使用长波长的红光或近红外光采集标本高分辨率荧光图像，对活性 标本的杀伤极小，因此非常适用于活细胞成像，尤其是厚的活组织如脑片、胚胎、整个器官 甚至整个机体的成像研究。 尽管典型的宽场显微镜（wield field fluorescence microscope ）通常可以在活体系 统中观察亚细胞水平的生物化学反应，但由于位于焦平面上或下次级荧光的强烈背景噪音影 响，该项技术在敏感度和空间分辨率上都存在明显的局限性。 激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning confocal microscope）使用共聚焦针孔阻 挡掉非焦平面的背景信息，可以在较厚的标本上采集薄的（微米以下）、去模糊的光学切片 图像，因此这项技术允许对厚标本进行三维切割。虽然我们可以只采集标本焦平面的信息， 但是激发光会穿透整个标本，会对标本尤其是活标本造成严重的光漂白和光毒性。此外共聚 焦显微镜会由于激发能量被标本吸收和散射及发射光受标本散射等影响，而使观察深度受到 严重限制。 反卷积（Deconvolution）技术通常在处理非焦平面背景较低的标本或荧光信号很低的 标本时，可以得到非常理想的结果。因为反卷积方法使用宽场显微镜取图，激发光可以保持 在很低的水平，所以反卷积通常可以用于采集相对较薄的活细胞图像。但需要注意的是多数 反卷积方法只是一个简单的非线性数据滤镜，不适合定量研究。只有真正的限制性迭代反卷 积运算（constrained iterative deconvolution ）才能提供进一步的定量研究。而且反卷积 运算是建立在宽场荧光显微镜的基础之上的，所以仍然不能适用于较厚标本的研究。此外， 由于反卷积需要大量的计算量，因此不能够给出快速的实验结果反馈。 多光子显微镜荧光的激发只发生在显微镜焦平面衍射斑限定的范围内，进而可以在厚的 生物标本内产生光学切片，而获得高的三维分辨率。通过在XY 平面进行扫描可以获得单层 光学切片，然后沿着Z 轴进行连续扫描后可以获得完整的三维图像。因为焦点的位置可以 1/17 OLYMPUS 北京 2007-5 被精确的确定和控制，多光子荧光非常适用于激发标本表层以下的荧光探针。这种高精度的 定点激发保证了对荧光染料的最小光漂白并减少了光破坏，进而增加了细胞的生活能力，可 以维持更长时间的细胞性能研究实验。此外，多光子技术应用的是近红外长波激发，允许穿 透的组织标本更深，并且减少了短波光在组织中的高度散射。上述这些优点保证了研究者可 以在厚的活组织样本上进行实验操作，如脑片、胚胎等，而这些实验使用其他显微技术是没 有办法实现的。 图1 是在多光子荧光显微镜实验中典型的结构框架。该示意图使用的显微镜是 OLYMSPU 前一代倒置IX70 显微镜 （但多数多光子共聚焦并不采用倒置显微镜，而是使用 正置的脑片观察用显微镜，用于观察厚的活脑片、组织片或活体）用于观察培养组织和厚 生物标本中的活细胞。对于常规的无荧光观察，位于载物台上部的透射光灯室用于常规显微 镜技术如明场、微分干涉称（DIC）、相差和浮雕相称（Hoffman）等。显微镜的右侧是多 光子显微镜首选的激光系统——钛－蓝宝石锁膜脉冲激光系统(Ti(titanium):Sapphire mode-locked pulsed laser system)，这种激光可以提供非常高的瞬间高强度激发峰，但其 平均能量却较低。激光的控制是通过其上部的电子部件，激光通过光导或通过透镜（反光镜） 组直接导入显微镜光口。 一个光电倍增管检测系统安装于显微镜的另外一个光口，该系统 可以驱动光束在物镜视野范围内快速逐行扫描。通过计算机采集数字图像并进行光学切片的 三维重建。 与传统共聚焦显微镜不同，图1 中展示的显微镜结构不需要在监测器前端放置共聚焦 针孔来采集三维分辨率，因此增加了发射荧光的检测效率。以往，多光子激发用的昂贵的、 操作复杂的脉冲激光系统限制了这项技术的应用，近期打包销售或相对成熟的商品化系统使 多光子荧光技术被应用到更多的研究中。