灵芝酸液体发酵及其分离纯化研究.pdfVIP

摘要 摘要 灵芝酸是灵芝中除多糖外另一类具有广泛生理活性的物质，被证明具有止痛、镇静、 抑制组织胺释放、解毒、保肝、抗肿瘤等活性。因此如何利用液态发酵大量生产灵芝酸 对扩大其应用范围具有极其重要的意义。本文以实现发酵法大量生产灵芝酸为目的，就 灵芝酸的测定方法、发酵工艺、分离提取、结构鉴定开展研究工作，主要研究结果如下： 1．研究了灵芝酸的薄层层析定性检测方法，以甲苯：乙酸乙酯：乙酸(13：4：O．4)作为展 显色时间的增加，颜色由黄一红一紫一褐色，表明其为三萜类物质。建立了紫外分 系数为O．9998，精密度实验、重复性实验和回收率实验的相对标准偏差分别为 O．56％，3．6％，1．1％。表明此法准确可靠，且简便、快速。 h h调节摇床转速175rpm，48 2．研究了溶解氧对灵芝酸发酵的影响。结果表明：前48 至发酵结束调节摇床转速75rpm的培养方式下生物量、胞外灵芝酸及胞内灵芝酸的 比自然发酵条件下(4．50m∥L·h)提高了20．7％；先摇床培养96h后静置培养60h的 方式下生物量、胞外灵芝酸及胞内灵芝酸的产量较自然发酵分别提高4．6％、56．1％、 30．7％，总灵芝酸平均生产强度(3．84m∥L·h)比自然发酵条件下(4．50m∥L·h)降低了 14．7％．研究了pH值对灵芝酸发酵的影响，未控制pH发酵条件下，生物量最大值 达到了11．14 4．5的发酵条件下，有利于灵芝酸的生成，总灵芝酸 g／L：控制恒定pH 产量最大为538．01 mg／L。由此提出了两段pH控制策略：发酵前期pH不加控制， 当pH降至4．5时，控制pH在4．5，应用此策略生物量、胞外及胞内灵芝酸的产量 较自然发酵分别提高了6．8％、7．5％、3．4％． 3．利用AB一8大孔吸附树脂提取分离发酵液中灵芝酸。实验结果表明上样的最佳条件 2，流速为2mL／min，此时AB-8树脂对灵芝酸的吸附量达8．837 为pH m∥g。最佳 洗脱方案为：水一20％乙醇一40％乙醇一95％乙醇。利用定性显色反应和薄板层析， 鉴定了95％乙醇洗脱流分含有灵芝三萜类成分。大孔树脂95％乙醇洗脱组分经反相 C一18柱和制备高效液相色谱分离，经HPLC检测分析，纯度达到92．5％．由其红外 光谱，质谱和1H—NMR图谱分析，确定该化合物的分子量为470，推断其为赤芝酸 F甲酯，其分子式为C28H3806，其结构类型为Ⅳ型。 4．利用单因子试验和响应面法优化了菌丝体中灵芝酸的提取工艺。结果表明在乙醇浓 时间2h的条件下，灵芝酸的提取率最高，为28．72 m∥g干菌丝。将提取得到的灵 芝酸，经有机溶剂萃取、硅胶柱层析等分离纯化步骤，得到组分A和组分B，薄层 层析检测，各有一个主要斑点，其Rf值分别为0．70、O．56。 关键词：灵芝酸；定性和定量分析；pH；溶解氧：优化；提取；分离纯化：结构鉴定 Abs打Bct AbstI翟ct Ganoderic a actiVe acids(GA)，pmductionbyG口玎o·妇r，竹口，甜c胁埘，isphysiological in compoundsa11d印pliedacesodyne，nervoussystHn，antihist锄inic liVer etc． from