大黄酸对破骨细胞形成及分化及影响.pdfVIP

中文摘要 大黄酸对破骨细胞形成及分化的影响 摘 要 目的：利用除去间质细胞的骨髓细胞培养系(前破骨细胞形成系)及小 鼠单核细胞RAW264．7细胞培养系分别诱导培养破骨前驱细胞及成熟破 骨细胞，研究大黄酸对两种体外培养的破骨细胞形成及分化的影响，观察 破骨细胞早期阶段及成熟阶段的形态学变化，为预防和治疗破骨细胞性骨 吸收性疾病提供一种新制剂。 方法：选用两种细胞培养系：除去间质细胞的骨髓细胞培养系(前破 骨细胞形成系)及小鼠单核细胞RAW264．7细胞培养系，进行体外破骨细 胞诱导培养，分别观察大黄酸对破骨前驱细胞及成熟破骨细胞形成、分化 的影响。 l细胞培养及药物添加： 烷麻醉后，在无菌条件下取其胫骨和股骨，去掉骨垢端暴露骨髓腔，然后用 lOml无菌注射器抽取不含血清的0c．MEM培养液冲洗骨髓腔，制取全骨 髓细胞，1500转／分离心5分钟后，弃去上清液，加入含15％胎牛血清的 仪．MEM培养液20ml，充分吹打混匀后形成单细胞悬液，此为全骨髓细胞 G10) 中过滤，除去骨髓间质细胞，搜集非附着性骨髓细胞10．12ml，利用细胞 cells／ml的细胞悬液13ml， 计数板，计算细胞数，然后配制浓度为2×106 入37℃、5％C02培养箱中培养，培养至第4天时更换培养液一次，共计 培养7天。 胞株，放入37℃水浴箱中快速复苏，用无菌吸管将细胞液移至15ml离心 管内，吸取生理盐水洗涤冻存管两次，一并将其移至上述离心管中，上离 中文摘要 培养液约10ml，充分吹打混匀形成单细胞悬液，根据实验要求培养细胞。 当细胞生长状态良好，长满瓶底壁约90％时进行消化，收集细胞，1000 转／分离心5分钟后，弃去上清液，加入含10％胎牛血清的1640培养液约 10ml，充分吹打混匀形成单细胞悬液，利用细胞计数板，计算细胞数， 104cells／ml的细胞悬液5ml，添加破骨细胞分化因 然后配制成浓度为4．5x 列，每孔加入细胞悬液150p1，然后将培养板放入37C、5％C02培养箱 中培养，培养和5天。 1．3药物添加：在4行6列的24孔培养板中添加药物大黄酸，使其终浓度 第一列为对照组。在96孔培养板中选择24个孔，使其呈4行6列，添加 个浓度每列4孔(n--4)，第-YU为对照组。 2抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色：破骨前驱细胞培养系培养至第7天 及RAW264．7细胞培养系培养至第5天后行TRAP染色，倒置光镜下观 察，计算并记录染色阳性细胞数。 3统计学分析：使用SPSSl3．0软件进行统计学分析。数据处理采用 t-test和非参数检验的方差分 mean士SD检验分析，数据资料采用Student’s 析，各不同浓度的加药组与对照组之间相比较。 结果： l前破骨细胞形成系： 1．1破骨前驱细胞的形态学特征经TRAP染色后，可见到大量染色阳性 的破骨前驱细胞，其形态学特征与成熟破骨细胞相似，但是细胞体积较小， 形态多样(见Fig．1)，可呈椭圆形、类圆形、四边形、条索状和不规则形等。 细胞大多为单核，也可见到2核者。 1．2大黄酸对破骨前驱细胞形成的抑制在前破骨细胞形成系中，10～、 计学分析，加药组对破骨前驱细胞的形成有抑制作用，当药物浓度为 100mol／L时，与对照组相比，对破骨前驱细胞的形成有显著抑制Q0．05) (见Fig．3和Tablel)。 中文摘要 2RAW264．7细胞培养系： 2．1破骨细胞样细胞(成熟破骨细胞)的形态学特征经TRAP染色后，可 见到大量破骨细胞样细胞，其形态学特征与成熟破骨细胞相似，细胞体积 较大，形态多样(见Fig．5)，可呈星形、圆形、类圆形、梭形、条索状及不 规则形。细胞核为多个。 2．2大黄酸对破骨细胞样细胞形成的抑制在RAW264．7细胞培养系