实验一、RNA提取方法及原理.pptVIP

实验一、RNA提取方法及原理 一、研究背景 二、方法及原理 一、研究背景 1. RNA研究的重要性 DNA，RNA和蛋白质是三种重要的生物大分子，是生命现象的分子基础。 DNA的遗传信息决定生命的主要性状，而mRNA在信息传递中起很重要的作用。其它两大类RNA，rRNA和tRNA，同样在蛋白质的生物合成中发挥不可替代的重要功能。因此mRNA、rRNA、tRNA在遗传信息由DNA传递到表现生命性状的蛋白质的过程中举足轻重。 2 RNA分布 二、方法及原理 1 、 RNA的提取流程 （1）样本前处理 （2）细胞裂解 （3） RNA的纯化及获得 RNA提取流程－－ 样品前处理注意点 RNA提取流程－－细胞裂解，以释放RNA 异硫氰酸胍/酚－TRNzol总RNA提取试剂 RNA提取流程－－ RNA的纯化及获得 2. RNA提取的注意事项 杜绝外源酶的污染 a.严格戴好口罩，手套。 b.实验所涉及的离心管，Tip 头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。 c.实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保 RNase-Free。 阻止内源酶的活性 a.选择合适的匀浆方法。 b.选择合适的裂解液。 c.控制好样品的起始量。 明确自己的抽提目的 a.任何裂解液系统在接近样品最大起始量时，抽提成功率急剧下降。 b.RNA 抽提成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功，而不是得率。  Rnase 污染的10大来源 1：手指头 2：枪头 3：水/缓冲液 4：实验台面 5：内源 Rnase 6：RNA 样品7：质粒抽提 8：RNA 保存 9：阳离子 (Ca, Mg) 10：后续实验所用的酶 复习核酸的提取方法 RNA的提取 苯酚水溶液提取 细胞破碎 → 匀浆等体积90％苯酚水溶液振荡→RNA、Pro分开→RNA、多糖（水层）； DNA、Pro（苯酚层） 冷酚法、热酚法，注意苯酚除杂 复习核酸的提取方法 DNA提取 浓盐法：1mol/L氯化钠溶液提取，＋含少量辛醇或戊醇的氯仿一起振荡除去蛋白质 或：先用稀盐除去RNA－Pro，再用浓盐提取 也可用苯酚法，苯酚层得到 DNA、Pro 复习核酸的提取方法 核酸的沉淀 DNA的等电点4-4.5，RNA的等电点2-2.5. 收集上面的的水样层后，RNA 可以通过异丙醇沉淀。 在除去水样层后，样品中的DNA 和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。 Trizol?试剂提RNA的原理 Trizol?试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂 。Trizol中含苯酚和异硫氰酸胍，可保护RNA免受RNase的污染。 Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，裂解细胞并释放出RNA,酸性条件使RNA与DNA分离,加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。 TRIzol法提取流程 1. 样品处理： 组织：取 100mg 组织（新鲜或 -70 ℃ 及液氮中保存的组织均可）置匀浆器中 ，加入 1ml Trizol 充分匀浆，匀浆液转1.5ml 离心管中,室温静置５ min 。 2 .加入 0.2ml 氯仿，振荡 15s ，静置 2min 。 3 .4 ℃ 离心， 13000g × 15min ，取上清。 4 .加入 与上清1:1的异丙醇(约0.5ml)，将管中液体轻轻混匀，室温静置 20min (-20 ℃，时间长效果更好)。 取200-300ul从5步往下做。 TRIzol法提取流程 5 .4 ℃ 离心， 13000g × 10min ，弃上清。 6 .加入 1ml 75% 乙醇，洗涤沉淀,将沉淀打碎。 4 ℃ ， 13000g × 5min ，弃上清。 7.100%乙醇,轻轻洗涤沉淀.(不用将沉淀打碎) 8. 晾干，加入适量的 H 2 O 溶解（100ul）（ 65 ℃ 促溶 10-15min ）。 9.定量。 RNA提取常见问题 RNA降解 RNA降解 OD260 /OD280 比值偏低 OD260 /OD280 比值偏低 电泳带型异常 下游实验效果不佳 RNA的保存 短期保存：可将RNA溶解于TE缓冲液(10mmol／L Tris，1mmol／L ED