RNAi基因抑制对细胞生长和增殖影响.pptVIP

第五部分 利用RNAi 研究ICF45  细胞内功能 1. 稳定沉默ICF45基因表达的克隆细胞株建立 2． 细胞形态和核变化 观察 3. 细胞生长和增殖能力 4. 细胞周期和DNA含量变化 5． 细胞凋亡率 6． p53表达 7. Centrosome and spindle 8. 微丝形态变化 RNAi的定义 RNAi是由dsRNA介导的由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。 RNAi 是指通过反义RNA与正链RNA 形成双链RNA 特异性地抑制靶基因的现象,它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(有义RNA 和反义RNA) ,从而诱导内源靶基因的mRNA 降解,达到阻止基因表达的目的 6.1 稳定沉默ICF45基因表达的 克隆细胞株建立 To construct pAVU6+27/ICF45 plasmid To transfect HeLa cells G418 screening 14days 470 ug/ml To Identify clone by IM and western blotting To Design siRNA against ICF45 To Construct SiRNA Expression Plasmid 稳定RNAi细胞株ICF45基因 表达被有效沉默 Fig. 5-3 Western blotting of RNAi cells Hairpin siRNA formed in vivo B. to detect the expression of ICF45 of RNAi cells Immunofluorecence Cell Shape RNAi Cell Results ICF45基因稳定沉默细胞株细胞形态发生了很大变化，细胞体积变得很大，形态变得极其不规则，一个细胞所占面积可以达到二三十个对照细胞所占的面积总和。 在这些变形细胞里，胞质分裂受阻，形成大量多核细胞（占总细胞15-20%)， 在一个细胞内细胞核数目从2个到12个不等，一些细胞膜起泡，核发生凝集和碎片化，出现凋亡小体，最后细胞破碎溶解走向凋亡。 Growth Curve of Cells FCM Cell Apoptotic Rate p53表达显著升高 Actin Spindle Centrosome and Tubulin Control cells U6+27 RNAi Cells Centrosome and DNA in RNAi Cells Centrosomes in Apoptosis Cells Control Cell Lines 第六部分 小结 在稳定沉默ICF45细胞株中，细胞发生诸多生理生化变化： 1. 形成大量多核细胞 （占总细胞 15-20%) 2. 细胞生长受到极大抑制 3. 软琼脂上不能形成克隆 These results suggest that ICF45 is a essential factor in cell growth, this is agreement with yeast homologous protein RGR024C, which is a essential gene. 小结续 4. DNA含量极大增加和大量多核细胞形成 5. 细胞凋亡率增加 6. p53表达水平显著升高 These results suggest that ICF45 被沉默后，基因组变得极不稳定，细胞通过p53诱导走向凋亡。 小结续 7. 中心体过度复制 8. 形成多极纺锤体和单极纺锤体 9. 胞质分裂受阻 10. 多核细胞大量形成 These results suggested that ICF45 could regulate centrosome duplication by some ways and further affect cell cycle progression