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酶 几乎所有的生物都能合成自身所需要的酶，包括许多病毒。 酶参与所有生命活动过程，其在细胞内的分布、含量、活性等随生物生长、发育及外界条件的改变而改变。 Ribozyme：具有催化能力的RNA。酶不都是蛋白质。 定义：由活细胞产生，能在体外和体内起同样催化的一类具有特殊空间结构的生物大分子，包括蛋白质和核酸等。 用于基因克隆的酶 ER 连接酶 DNA聚合酶:Klenow酶、Taq酶、反转录酶、 末端转移酶 碱性磷酸酶 多核苷酸激酶 核酸酶 RE 如果在细菌中没有发现ER，现代生物学和重组DNA就不可能发展起来。 enzymes activity 1个活性单位：在适当的反应条件下 包括温度、pH和离子强度等 ,1h 内在50μl容积中完全酶解1ug特定DNA底物 通常用λDNA 所需要的酶量。 星号活力 在非标准反应条件下,也能切割一些与其特异识别序列类似的序列。在酶的名称右上角加一个星号 * 表示,如EcoRⅠ*。 因此,只有在相当特殊的条件下,酶活才与发表的结果相符。 必须采用规范的实验步骤,坚持应用推荐的反应条件。 底物位点优势效应 酶对同一个DNA底物上的不同酶切位点的切割速率不同 * Enzymes for Molecular Cloning Restriction Endonuclease definition:molecular knives Hundreds known, commercially available. function: R-M defense mechanism against foreign DNA. prevent invasion by foreign DNA such as viral DNA,by cutting it up. 修饰酶又称甲基化酶。 三大类 I：最早发现 3个亚基： HsdS—识别特定DNA序列 HsdM-甲基化 HsdR-限制性内切酶功能 三个亚基组成复合体，全酶才有活性。 biochemistry：need ATP,Mg++,SAM cutting：long sequences 1000-5000nt ,at random unspecial,can’t be used in genetic engineering III： 2个亚基组成： HsdM、 HsdR 需要SAM、ATP、Mg2+ 类似于I 应用同样受限制 II: 应用最广 酶最简单 Mg2+ 不需要特殊条件 HsdM 和 HsdR亚单位 切割特异 derivation： first three names from the latin names of the microorganism that produces them. first letter genus ,next two letters species writing：前三个字母用斜体，其他用正体表示。 如果酶存在于一种特殊菌株中，三个字母后加上菌株名称符号,名称最后部分往往包含罗马数字,表示在该特殊菌株中发现这种酶的先后次序。 recognition sequence: cleave DNA symmetrically in both strands at short palindromic symmetrical recognition sequences to leave a 5’-phosphate and a 3’-OH. They leave blunt ends,or protruding 5’- or 3’-termini. EcoRⅠ: ↓ * 5＇G A A T T C 3＇ 3＇C T T A A G 5＇ * ↑ recognition sequence enzymes 5＇ GTT AAC 3＇ Hpa Ⅰ blunt end 3＇ CAA↓TTG 5＇ 5＇ G↓AATTC 3＇ EcoRⅠ 5’protruding end 3＇ CTTAA↑G 5＇ 5＇ A↓AGCTT 3＇ HindⅢ 5’protruding end 3＇ TTCGA↑A 5＇ 5＇ G↓GATCC 3＇ BamHⅠ 5’protruding end 3＇ CCTAG↑G 5＇ 5＇ C↓TGCAG 3＇ PstⅠ 3’protruding end 3＇ GACGT↑C 5＇ 估算ER识别序列在DNA上出现的频率: 识别序列的频率 1/4N Sau3A 4bp 1/4 4 256bp EcoRI、PstI 6bp 1/46 4096 NotI 8bp 1/48 65536 rare cutters 仅是理