苯丙氨酸解氨酶的纯化及活性测定.docVIP

苯丙氨酸解氨酶的纯化及活性测定 一、? 目的 掌握纯化酶的基本操作和方法；学习一种常用的酶活力测定法。 二、 原理 苯丙氨酸解氨酶（ L-phenylalanine ： ammonia lyase, 简称 PAL ； EC4 . 3 . 1 . 5 ）是植物体内苯丙烷类代谢的关键酶，与一些重要的次生物质如木质素、异黄酮类植保素、黄酮类色素等合成密切有关，在植物正常生长发育和抵御病菌侵害过程中起重要作用。 PAL 催化 L- 苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸和氨，反式肉桂酸在 290nm 处有最大吸收值。若酶的加入量适当， A290 升高的速率可在几小时内保持不变，因此通过测定 A290 升高的速率以测定 PAL 活力。规定 1h 内 A 290 增加 0 . Ol 为 PAL 的一个活力单位。 三、试剂和材料 (1) 0.l mol 硼酸一硼砂缓冲液 (pH8.7) (2) 酶提取液 0 .1 mol/ I 硼酸一硼砂缓冲液（含 1 mmol/ I, EDTA, 20mmol/ L β一巯基乙醇） （ 3 ） 0 . 6m.ol/ I- L 一苯丙氨酸溶液 （ 4 ） 6 mol/ l HCl (5 ）固体硫酸铵 (6 ） 0. 02mol/l- 磷酸盐缓冲液（ pH8.0, 含 0 . 5 mmol/ L EDTA, 2.5% 甘油， 20nlmol/ l . β -