SOD-TAT融合蛋白结晶和初步的X-射线衍射分析.pptVIP

* SOD-TAT融合蛋白结晶和初步的X-射线衍射分析 * 研 究 背 景 超氧化物歧化酶（SODs）是??一类催化歧化成氧和过氧化氢的过氧化物酶。在哺乳动物细胞中的超氧化物歧化酶有三种已知的形式：含锰的超氧化物歧化酶（Mn-SOD），含铜和锌的超氧化物歧化酶（CuZn-SOD）和细胞外超氧化物歧化酶（EC-SOD）。超氧化物歧化酶（SOD）对于保护利用氧的细胞免受活性氧物种（ROS）毒性是非常必要的。 SOD-TAT ：能够渗透细胞膜的超氧化物歧化酶，由基因重组技术制得。实验证实，SOD-TAT可以直接穿透细胞膜的脂质外层而导入哺乳动物细胞。随后的研究表明，SOD-TAT能够有效地防止缺血性脑损伤，预防和治疗豚鼠由单一剂量的UVB辐射所造成的皮肤损害（Kim等，2005; Pan等人，2009年，2010 ）。 * 要了解SOD-TAT的生化功能，确定其三维晶体结构是非常有价值的。在这项实验中，研究了在毕赤酵母中的表达及SOD-TAT融合蛋白的纯化和结晶。此外，从SOD-TAT晶体收集衍射数据，以3.20分辨率处理。这些结果将为SOD-TAT的最终结构（揭示这种蛋白质在细胞渗透过程的生化作用）的测定提供基础。 * 材料及方法 1.SOD-TAT表达菌株的构建 2.SOD-TAT的表达 限制性内切酶XhoI和XbaI先把人工合成的质粒pBluescript II SK(+) (pBS) SOD-TAT编码区的5’、3’端切下，转接到pPICZaA质粒上，得到重组质粒pPICZaA-SOD-TAT。10微克pPICZaA-SOD-TAT用SacⅠ线性化，并通过电穿孔整合到毕赤酵母X-33株基因组中。转化体铺于含100微克/毫升抗生素的YPDS板上。抗生素抗性菌落作为表达菌株。 抗生素阳性菌落接种到100毫升酵母浸出粉胨葡萄糖（每ml包含100ug的抗生素）在303 K温度下培养1d，每min摇晃200次。收获细胞，用无菌水洗涤并重新悬浮在BSM介质。根据毕赤酵母发酵过程指南，重组SOD-TAT在303 K条件下第8d表达。每隔24 h加入1.0％的甲醇以诱导SOD-TAT的分泌。 * 材料及方法 3.蛋白质的纯化 4.结晶和X射线数据 2g冻干蛋白粉溶解在10ml20mM磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中，pH为6.0，离心。上层清液脱盐，加入一个离子交换层析柱，用20 mM磷酸盐 - 柠檬酸盐缓冲液pH6.0在室温下以1ml/min的流速预平衡。用20 mM磷酸盐柠檬酸盐缓冲液（含0.4和1M的NaCl）进行洗脱。蛋白质纯度通过SDS和考马斯亮蓝染色确定。汇集超氧化物歧化酶活性峰部分，脱盐，浓缩至36mg/ml，并存储在253 K下直到使用。 使用一个内部PEG筛选试剂盒筛选结晶的初始状况。SOD-TAT融合蛋白的结晶试验在287K下在24孔板中使用悬滴气相扩散法。通常，2毫升贮存溶液与2ml蛋白质溶液混合用1ml贮存溶液平衡。衍射数据用同步辐射装置光束线BL17U1收集。衍射实验在100 K温度下进行，图像用ADSC Q315r的CCD区域检测器记录。收集波长为0.9792埃、3.20埃分辨率下的实验数据。数据强度用HKL-2000套件进行了整合和扩展。 * SOD-TAT融合蛋白的分离纯化。考马斯亮蓝染色，然后使用12.5％的SDS对蛋白样品进行了分析。 带1：分解的SOD-TAT 带2：未分解的SOD-TAT * 实验所得数据 * 结论 一周后，SOD-TAT的小晶体，从0.1M氯化钠、0.05M的Tris-HCl（pH为8.0），12％的聚乙二醇3350得到。为了获得高质量衍射晶体，许多变量被改变。包括盐的类型，Tris-HCl缓冲液的pH值，PEG3350的浓度等。经过进一步的优化，使用0.05M的氯化镁，0.05M的Tris-HCl pH 8.5，15％PEG 3350，2.5％甘油得到衍射晶体（图2）。 OD-TAT融合蛋白结晶衍射到3.20分辨率，属于单斜晶系，空间群C121，晶胞参数为a = 181.83, b = 112.58, c =82.57，衍射数据的收集和处理（表1），最终Rmerge值11.5％（39.3％的最高分辨率）。 * 采用悬滴汽扩散法得到的SOD-TAT融合蛋白的晶体生长 * 用SOD-TAT晶体数据计算自旋转函数所得到的平面投影 * 谢 谢 观 看！